Information

Begränsningsendonukleas finns i?

Begränsningsendonukleas finns i?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Citat från: Scientific American juli 1975 Manipulation av gener av Stanley Cohen:

Restriktionsendonukleaser (och modifieringsmetylaser) är utbredda i mikroorganismer; gener för tillverkning de hittades på virala kromosomer och extrakromosomalt plasmid-DNA såväl som på många bakteriella kromosomer.

Varför skulle generna för att göra RE hittas på virala kromosomer? Kan du också ge några exempel där de finns på plasmider?


Det finns många förslag på den ekologiska rollen för restriktionsmodifieringssystem (RM) och varför de skulle finnas på mobila genetiska element (t.ex. plasmider och virus). I det här fallet talar jag specifikt om de virus som infekterar bakterier (aka, bakteriofag).

1) RM-system kan ha en antiviral funktion. Normalt skulle vi tänka på sådana system som en del av värdkromosomen, men som Alan Boyd föreslog, när en tempererad fag väl har integrerat sig i kromosomen, är dess kondition knuten till dess värd. Därför kan ett RM-system som finns i en profag förhindra infektioner av ytterligare fag. Se här för en diskussion om denna fråga: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23471617

2) RM-system kan ha "beroendeframkallande" egenskaper genom att fungera som toxin-antitoxinsystem. I grund och botten betyder detta att om generna för RM -systemet går förlorade dör värdcellen. Detta kan ge selektering för underhåll av plasmider och profagage inuti värdcellen. Se här för en diskussion om denna fråga: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3874152/

3) Slutligen behöver virus förstöra värdgenomet - både för att undertrycka alla antivirala svar och för att frigöra näringsämnen för viral replikation. Även om detta vanligtvis uppnås med andra nukleaser än restriktionsendonukleaser, finns det åtminstone en situation där en RE verkar vara inblandad. Detta diskuteras i den första länken ovan (se avsnittet "Roll in Nutrition")


Om du har ett dsDNA -genom och replikerar det genom rullande cirkel som de flesta bakteriofager och många plasmider gör, är ett endonukleas i stort sett en nödvändighet.


Det välkända restriktionsenzymet EcoRI är plasmidkodat.

Betlach et al. (1976) En restriktionsendonukleasanalys av den bakteriella plasmiden som kontrollerar EcoRI-restriktionen och modifieringen av DNA. Fed. Proc. 35:2037 - 43.

För ett exempel på ett fagkodat system, se:

Dempsey et al. (2005) Sau421, ett BcgI-liknande restriktionsmodifieringssystem kodat av Staphylococcus aureus fyrdubbelkonverterande fag Phi42. Microbiology 151: 1301-1311

Denna andra uppsats föreslår ett svar på varför en fag skulle ha ett sådant system: lysogener av Phi42 är resistenta mot infektion av alla 23 medlemmar i en standarduppsättning av S. aureus fag. När en fag har lysogeniserat är det i dess intresse att förhindra lysering av dess värd.


Restriktionsmodifieringssystem

De restriktionsmodifieringssystem (RM -system) finns i bakterier och andra prokaryota organismer, och ger ett försvar mot främmande DNA, såsom det som bärs av bakteriofager.

Bakterier har restriktionsenzymer, även kallade restriktionsendonukleaser, som klyver dubbelsträngat DNA vid specifika punkter till fragment, som sedan nedbryts ytterligare av andra endonukleaser. Detta förhindrar infektion genom att effektivt förstöra det främmande DNA som introduceras av ett smittämne (som en bakteriofag). Ungefär en fjärdedel av de kända bakterierna har RM-system och av dem har ungefär hälften mer än en typ av system.

Eftersom sekvenserna som känns igen av restriktionsenzymerna är mycket korta, kommer bakterien själv nästan säkert att innehålla några i sitt genom. För att förhindra förstörelse av sitt eget DNA med restriktionsenzymerna tillsätts metylgrupper. Dessa modifieringar får inte störa DNA-basparningen, och därför modifieras vanligtvis endast ett fåtal specifika baser på varje sträng.

Endonukleaser klyver interna/icke-terminala fosfodiesterbindningar. De gör det först efter att ha identifierat specifika sekvenser i DNA som vanligtvis är 4-6 baspar långa och ofta palindromiska.


Restriktionsendonukleaser används för in vitro DNA-syntes som syntetiseras av bakterier som en del av deras försvarsmekanism.

Restriktionsendonukleaser används för in vitro DNA -syntes syntetiserad av bakterier som en del av deras försvarsmekanismer som finns i däggdjursceller för nedbrytning av DNA när cellen dör som används vid genteknik för ligering av två DNA -molekyler

Bioteknik: Principer och processer

d. Produktkon 143. Den första kliniska genterapin gavs 1990 till en fyraårig flicka som led av SCID. Processen involverade a. Överföring av ADA -gen till blodet b. Behandling med enzymersättningsterapi c. Införande av funktionellt ADAC-DNA (med användning av en retroviral vektor) i patientens lymfocyter, som sedan återförs till patienten d. Överföring av ADA-gen via DNA-vaccinmetod

Bioteknik: Principer och processer

S 36. Vilket enzym kommer att produceras i en cell där det finns en nonsensmutation i lac Y-genen? (1) Laktospermeas och transacetylas (2) ß-galaktosidas (3) Laktospermeas (4) Transacetylas

Bioteknik: Principer och processer

Vilka av följande joner stimulerar snabb frisättning av elektroner från vatten? (1) Mg ++ (2) Cat+ (4) Mn ++ (3) CH-


DNA -begränsning och modifiering

Mångfald och evolution

RM-enzymer kan dissekeras i moduler. En typ II MTase omfattar en TRD och en modul som är ansvarig för att katalysera överföringen av metylgruppen från AdoMet till den definierade positionen på den relevanta basen. De katalytiska domänerna delar sekvenslikheter, och dessa är mest lika när den katalytiska reaktionen är densamma, det vill säga ger samma produkt (t.ex. 5 mC). Med tanke på matchningsspecificiteterna för kognat ENas och MTase kan det förväntas att deras TRD skulle ha liknande aminosyrasekvens. Detta är inte fallet, det verkar troligt att de två enzymerna använder olika strategier för att känna igen sin målsekvens. Varje subenhet av det dimera ENaset behöver känna igen hälften av den rotationssymmetriska sekvensen medan det monomera MTaset måste känna igen hela sekvensen. Frånvaron av likhet mellan TRD:erna för ENase och dess besläktade MTase antyder att de kan ha utvecklats från olika ursprung.

Restriktionsenzymer som känner igen samma målsekvens kallas isoschizomerer. En enkel förväntan är att TRD:erna för två sådana enzymer skulle vara mycket lika. Detta är inte nödvändigtvis så. Dessutom verkar de observerade likheterna inte korrelera med taxonomiskt avstånd. Aminosyrasekvenserna för isoschizomererna HaeIII och NgoPII, som är isolerade från bakterier i samma filum, visar liten, om någon, likhet medan isoschizomererna FnuDI och NgoPII, som är isolerade från bakterier i olika filerna, är mycket lika (59% identitet).

Typ I R-M-system är komplexa i sammansättning och besvärliga i sitt verkningssätt, men de är väl lämpade för diversifiering av sekvensspecificitet. En enda subenhet (HsdS eller S) ger specificitet för hela R-M-komplexet och till det ytterligare mindre komplexet som är en MTase. Varje förändring i specificitet påverkar begränsning och modifiering samtidigt. I överensstämmelse med deras potential att utveckla nya specificiteter existerar typ I-system som familjer inom vilka medlemmar, till exempel EcoKI och EcoBI, endast särskiljs av sina S-subenheter. För närvarande har allelgener identifierats för minst sju medlemmar av en familj där varje medlem har olika specificitet. Det är mer överraskande att upptäcka att alleliska gener i E coli, och dess släktingar, specificerar också minst ytterligare två familjer av typ I -enzymer. Medan familjemedlemmar endast inkluderar stora sekvensskillnader i deras S -polypeptider, delar de i olika familjer mycket begränsade sekvensidentiteter (vanligtvis 18–30%). Det är uppenbart att skillnaderna mellan gensekvenser för typ I R-M-system inte är någon indikation på den fylogenetiska släktskapen hos de stammar som kodar dem. Det är av intresse att notera att trots den allmänna frånvaron av sekvenslikheter mellan medlemmar i olika familjer av typ I -enzymer har uttalade likheter identifierats för TRD från olika familjer när de ger samma sekvensspecificitet.

Informationen från gensekvenser för både typ I och typ II -system, enligt Raleigh och Brooks, 1998, "ger en bild av en pool av gener som har cirkulerat med få taxonomiska begränsningar under mycket lång tid".

Allelisk variabilitet är en av de mest slående egenskaperna hos Type I R-M-system. Både den tvådelade och asymmetriska naturen hos målsekvensen erbjuder mer utrymme för mångfald av sekvensspecificitet än de symmetriska igenkänningssekvenserna för typ II-system. S -subenheten för typ I -enzymer inkluderar två TRD, var och en specificerar en komponent i målsekvensen. Denna organisation av domäner gör underenheten väl lämpad för generering av nya specificiteter som konsekvenserna av antingen nya kombinationer av TRD:er eller mindre förändringar i avståndet mellan TRD:er. I det första fallet associerar rekombination bara regionerna som specificerar TRD: erna och i det andra leder ojämlik övergång inom en kort duplicerad sekvens till en förändring i avståndet mellan TRD: erna. Båda dessa processer har inträffat i laboratoriet av en slump, liksom av design. Skyddet av omodifierade målsekvenser i värdkromosomen, genom begränsningslindring, ökar möjligheten för förändringar i specificitet.

Medan många bakterier bevarar den nära kopplingen mellan de tre generna av typ I R-M-system (hsdR, hsdM, och hsdS figur 2 ), har ett antal bakterier beskrivits som innehåller flera kopior av hsdS som är fasvariabel. Blandning av DNA -sekvenserna som kodar TRD för olika HsdS -proteiner ger en dynamisk metod för varierande specificitet. I Mycoplasma pulmonis, det finns två exempel på "shufflons", system som rekombineras hsdS gener. Båda shufflons innehåller hsdR och hsdM gener som flankeras av två hsdS gener som är inverterade i förhållande till varandra. Rekombination mellan dessa två kopior av hsdS kan generera fyra olika målspecificiteter. En mer komplex shufflon finns i genomet hos den mänskliga kommensalen Bacteroides fragilis, som innehåller en hsd lokus med kapacitet att generera åtta HsdS -proteiner med olika specificiteter.

För typ I R-M-system kan byte eller omplacering av domäner skapa enzymer med nya specificiteter, men utvecklingen av nya TRD med olika specificiteter har inte bevittnats. I ett experiment starkt urval för en förändring som tillät en degeneration på en av de sju positionerna inom målsekvensen misslyckades med att ge mutanter med en avslappnad specificitet.


11.1: Restriktionsendonukleaser

  • Bidragit av Clare M. O&rsquoConnor
  • Docent emeritus (biologi) vid Boston College

System för begränsning/modifiering av bakterier skyddar mot inkräktare

Upptäckten av restriktionsenzymer eller restriktionsendonukleaser (RE) var avgörande för utvecklingen av molekylär kloning. RE förekommer naturligt i bakterier, där de specifikt känner igen korta sträckor av nukleotider i DNA och katalyserar dubbelsträngspauser vid eller nära
igenkänningsstället (även känt som ett restriktionsställe). Hittills har tusentals RE med olika särdrag beskrivits. Du kanske undrar varför bakterier har dessa potentiellt destruktiva enzymer. RE är en del av ett bakteriellt försvarssystem mot främmande DNA, såsom en infektiös bakteriofag. RE -platserna i bakterien & rsquos eget DNA skyddas från klyvning eftersom de har modifierats av ett metyltransferas som specifikt modifierar RE -platserna. De kombinerade aktiviteterna för endonukleaset och metyltransferas kallas ett restriktions-/ modifieringssystem. Idag renas de flesta kommersiellt tillgängliga RE inte från sina naturliga källor. Istället isoleras RE vanligtvis från bakterier som överuttrycker stora mängder RE från plasmider. Dessa rekombinanta RE har ofta konstruerats av molekylärbiologer för att inkludera aminosyraförändringar som ökar den katalytiska aktiviteten eller stabiliteten hos RE.

För att förstå hur RE fungerar kommer vi att använda EcoRI, en av de bäst studerade RE, som exempel. Även om namnen på enskilda RE kan låta lite som babysnack, är nomenklaturen faktiskt väldigt systematisk och baseras på dess biologiska källa. EcoRI finns naturligt i RY13 -stammen av Escherichia coli. Dess namn börjar med släktet och arten (Eco for E coli), följt av en stamidentifierare (R för RY13), och slutar med en romersk siffra som särskiljer de olika RE som finns i stammen. Sila RY13 av E coli innehåller flera RE, men bara EcoRI och EcoRV, används i stor utsträckning inom molekylärbiologi.

Restriktionsenzymer klyver specifika ställen i DNA

Restriktionsenzymer som EcoRI kallas ofta 6-cutters, eftersom de känner igen en 6-nukleotidsekvens. Om vi ​​antar en slumpmässig fördelning av A, C, G och Ts i DNA, förutsäger sannolikheten att ett igenkänningsställe för en 6-skärare ska inträffa ungefär en gång för varje 4096 bp (4 6) i DNA. Naturligtvis är fördelningen av nukleotider i DNA inte slumpmässig, så de faktiska storlekarna på DNA-fragment som produceras av EcoRI varierar från hundratals till många tusen baspar, men medelstorleken är nära 4000 bp. DNA-fragment av denna längd är användbara i laboratoriet, eftersom de är tillräckligt långa för att innehålla den kodande sekvensen för proteiner och är väl upplösta på agarosgeler.

EcoRI känner igen sekvensen G A A T T C i dubbelsträngat DNA. Denna igenkänningssekvens är ett palindrom med en tvåfaldig symmetriaxel, eftersom läsning från 5&rsquo till 3&rsquo på endera strängen av helixen ger samma sekvens. Den palindromiska karaktären hos restriktionsstället är mer uppenbart i figuren nedan. Punkten i mitten av restriktionsplatsen anger symmetriaxeln. EcoRI katalyserar hydrolysen av fosfodiesterbindningarna mellan G och A på båda DNA-strängarna. Restriktionsfragmenten som genereras i reaktionen har korta ensträngade svansar vid 5 & rsquo-ändarna. Dessa ändar kallas ofta för & ldquosticky -ändar, & rdquo på grund av deras förmåga att bilda vätebindningar med komplementära DNA -sekvenser.

RE kallas ibland för molekylär sax på grund av deras förmåga att generera restriktionsfragment som slutar med definierade sekvenser. Dessa &ldquoklibbiga ändar&rdquo är viktiga för rekombinant DNA-teknik, eftersom de gör det möjligt för forskare att konstruera designade DNA-molekyler. Alla två DNA -molekyler med kompatibla klibbiga ändar kan sammanfogas av DNA -ligaser som fungerar som & ldquopaste & rdquo genom återförsegling av brutna fosfodiesterbindningar. Vi kommer inte att generera rekombinanta molekyler i den här klassen, men det är viktigt att förstå deras betydelse för modern biologi. Tänk på pBG1805- och pYES2.1 -plasmiderna. Från plasmidkartorna i kapitel 10 kan du se att dessa komplexa plasmider konstruerades genom att sy ihop DNA -sekvenser från evolutionära distinkta källor.


Introduktion

Restriktionsenzymer kallas också "molekylära saxar" eftersom de klyver DNA vid eller nära specifika igenkänningssekvenser kända som restriktionsställen. Dessa enzymer gör ett snitt på var och en av de två DNA -strängarna och kallas också restriktionsendonukleaser. 4

Virus infekterar värdcellerna genom att injicera deras DNA i cellerna. Detta virala DNA kapar värdcellens maskineri för reproduktion av viral avkomma, vilket resulterar i värdcellens död. För att övervinna virusinfektionen har många bakterier och arkéer utvecklat flera mekanismer. En viktig skyddsmekanism innefattar användning av restriktionsenzymer för att bryta ned det invaderande virala DNA: t genom att klyva det vid specifika restriktionsställen. Samtidigt skyddar värdcellen sitt eget DNA från att klyvas genom att använda andra enzymer som kallas metylaser, som metylerar adenin- eller cytosinbaser inom värdigenkänningssekvenser. För vart och ett av restriktionsenzymet producerar värdcellen ett motsvarande metylas som metylerar och skyddar värd -DNA: t från nedbrytning. Dessa enzymer utgör restriktionsmodifieringssystemen (R-M).

Restriktionsenzymerna katalyserar hydrolysen av bindningen mellan 3'-syreatomen och fosforatomen i fosfodiester-ryggraden i DNA. Enzymerna kräver Mg 2+ eller andra tvåvärda joner för deras aktivitet.


Restriktionsenzymfunktion

Restriktionsenzymfunktionen i den naturliga världen är att försvara bakterier mot specifika virus som kallas bakteriofager. Dessa virus angriper bakterier genom att injicera viralt RNA eller DNA i en bakteriell plasmid (liten, lila ring i bilden nedan) och replikera där. Om viralt RNA eller DNA detekteras i en prokaryotcell kan den cellen ofta stoppa replikationsprocessen genom att skära igenom den främmande genetiska informationen. Detta gör det värdelöst. Samtidigt skyddas bakteriellt DNA från skärverkan av dess restriktionsendonukleaser inom dess restriktionsställen. Denna mekanism lägger till metyl (H3C) grupper till cytosin och adenin i bakteriellt DNA utan att påverka den kodade DNA -sekvensen.

Hittills har cirka 3500 restriktionsenzymer isolerats från bakteriella plasmider. Varje enzym känner igen en specifik sekvens av viral genetisk kod och kommer att försöka separera den nya, muterade DNA -strängen nära eller längre bort från igenkänningsstället. Denna naturliga separationsmekanism kallas också restriktionsenzymsmältning.

Inte bara platsen och metoden utan också typen av skär kan skilja sig åt. Vissa RE lämnar ojämna klibbiga ändar (icke-trubbiga ändar) mellan lite olika områden av en dubbelsträng som överhänger andra lämnar trubbiga ändar där baspar separeras vid samma punkt. Till exempel är BamHI ett typ II-restriktionsenzym erhållet från Escherichia coli som känner igen nukleotidsekvensen GGATCC och klyver dessa sektioner av DNA och lämnar klibbiga ändar. Klyvning, som att klyva en stock med en yxa, är den vetenskapligt accepterade termen för att skära en DNA-sträng.

På bilden nedan klyver ett restriktionsenzym som kallas HindIII DNA vid olika punkter på de två strängarna för att bilda en klibbig ände.


Historia av restriktionsenzymer

I början av 1950-talet observerade ett antal forskarlag skillnader i effektiviteten av bakteriofaginfektion på olika bakteriella värdstammar av samma art [2,3]. Detta beskrevs av Grasso och Paigen: När fag λ förökade sig i en bakteriestam (t.ex. E coli C) användes för att infektera en annan stam av samma bakterieart (t.ex. E coli K) noterades en markant minskning av infektionshastigheten jämfört med återinfektion av värdstammen (E coli C). Den nya värden (E coli K) verkade välja mot eller "begränsa" den inkommande fagen. Forskarna noterade också att detta inte var ett ärftligt fenomen, eftersom fagen som växte på den nya stammen kunde infektera den stammen med mer typiska hastigheter efter en infektionsomgång. Det observerade fenomenet definierades som "värdkontrollvariation" och blev ett område för intensiv forskning för att upptäcka de underliggande mekanismerna [4].

Det var inte förrän på 1960 -talet som mekanismer som låg till grund för värdkontrollvariation bestämdes att involvera enzymatisk klyvning av fag -DNA, vilket ledde till upptäckt och isolering av restriktionsenzymer. I början av 1960-talet observerade Werner Arber att värdintervallet bestämde sig för fag-DNA, och efterföljande experiment visade att metionin var inblandat i värdskydd [5]. Dessa fynd ledde slutligen till förslaget om ett restriktionsmodifieringssystem (RM), där ett restriktionsenzym och ett metylas från värden arbetar tillsammans för att klyva främmande viralt (icke-metylerat) DNA samtidigt som värd-DNA: t skyddas genom metylering [6 ].

Intressant nog var det mesta av det tidiga arbetet med R-M-system på typ I- och III-grupper av restriktionsenzymer, klassificerade utifrån aspekter av deras struktur och funktion (se Restriktionsenzymklassificering). Den fullständiga användningen av restriktionsenzymer blev dock inte uppenbar förrän Kent Wilcox och Hamilton Smith upptäckte HindII, det första restriktionsenzymet av typ II -klassen [7]. HindII känner igen en specifik symmetrisk DNA -sekvens och klyver på ett definierat sätt inom denna igenkänningssekvens. Denna funktion, som finns i de flesta tidiga typ II -restriktionsenzymerna, fick Kathleen Danna och Daniel Nathans att använda HindII i den fysiska kartläggningen av simianvirus 40 DNA [8], en process som kallas restriktionsenzymmappning.

För sitt banbrytande arbete med restriktionsenzymer tilldelades Daniel Nathans, Hamilton Smith och Werner Arber 1978 Nobelpriset i fysiologi eller medicin. Med upptäckten av DNA-ligas, i kombination med den växande familjen av platsspecifika skärande restriktionsenzymer, föddes rekombinant DNA-teknologi.


Metylering

DNA-metylering är en av de vanligaste typerna av DNA-modifiering som finns i både eukaryoter och prokaryoter. Hos bakterier är det en del av restriktionsmodifierings (R-M) försvarssystem mot faginfektion (se grundläggande restriktionsenzym), där värdbakterier skyddar sitt eget DNA mot klyvning av sina endogena restriktionsenzymer. Metylering sker vanligen vid cytosin (C) och adenin (A) baser och bildar övervägande 5-metylcytosin (m 5C), N4-metylcytosin (m 4C) och N6-metyladenin (m 6A) derivat.

DNA-metyltransferaser driver metyleringsreaktionen genom att överföra en metylgrupp från en donator till acceptorbaserna (t.ex. A och C). De vanligaste typerna av DNA -metyltransferaser som finns i laboratoriestammar av bakterier inkluderar:

  • Damm: står för deoxyadenosin metyltransferas och omvandlar sekvensen 5'-GATC-3 'till 5'-G (m 6A) TC-3'
  • Dcm: står för deoxicytosin metyltransferas och omvandlar sekvensen 5'-CCWGG-3' till 5'-C(m 5C)WGG-3' (där W är antingen A eller T)
  • EcoKI: står för typ I R-M-systemet i E coli K12-stam och modifierar adenosiner i sekvensen 5'-AAC(N)6GTGC-3 ′
  • EcoBI: står för Type I R-M-systemet i E coli B-stam och modifierar adenosiner i sekvensen 5'-TGA(N)8TGCT-3′

I däggdjurs- och växtsystem är CpG- eller CpNpG-metylering en vanlig DNA-modifiering med implikationer i biologiska processer, vilket gör det till ett stort fokus för epigenetiska studier.

Restriktionsenzymernas känslighet mot metylerade DNA -igenkänningsställen beror på restriktionsenzymerna. Till exempel, som illustreras i Figur 4, Dam-metylering vid GATC blockerar fullständigt MboI men aktiverar Dpnl. Å andra sidan blockerar CpG-metylering vid 5'-CCGG-3 'HpaII-aktivitet men har ingen effekt på MspI. I vissa fall hämmas restriktionsenzymaktivitet endast delvis av metylering (t.ex. XhoI).

Figur 4. Varierande känslighet hos restriktionsenzymer mot substrat-DNA-metylering.

Vid förökning av plasmider i bakterier måste effekterna av metylering på restriktionsenzymer av intresse beaktas. För att förhindra metylering vid 5′-GATC-3 ′ och 5′-CCWGG-3 ′, kompetenta celler som saknar Dam- och Dcm-metylaser (damm – /dcm -) bör väljas för plasmidtransformation. Mest E coli celler har inte ett CpG-metyleringssystem, så CpG-metylering är inte ett problem för DNA isolerat från bakterier. Om genomiskt DNA extraheras från växter och däggdjur kan metylering inträffa vid CpG-ställena och påverka direkt restriktionsuppslutning av vissa metyleringskänsliga enzymer.


Typer av begränsnings- och modifieringssystem (R-M):

Typ I -enzymer:- Typ I-restriktionsenzymer uppvisar både restriktions- och DNA-modifieringsaktiviteter. De kräver kofaktorer som Mg2+ -joner, S-adenosylmetionin (SAM) och ATP för deras aktivitet. Genkänningssekvenserna är ganska långa utan igenkännbara funktioner som symmetri. Typ I restriktionsendonukleaser klyver DNA vid ospecifika ställen och som kan vara 1000 baspar eller mer från igenkänningssekvensen. Eftersom metyleringsreaktionen utförs av samma enzym som förmedlar klyvning kan emellertid mål -DNA modifieras innan det skärs. På grund av dessa egenskaper är typ I-systemen av ringa värde för genmanipulation.

Typ II -enzymer :- Typ II-enzymer och deras motsvarande modifieringsmetyltransferaser fungerar som separata proteiner. De har ett antal fördelar jämfört med typ I och III system. För det första medieras restriktion och modifiering av separata enzymer så att det är möjligt att klyva DNA i frånvaro av modifiering. För det andra kräver restriktionsaktiviteterna inte kofaktorer såsom ATP eller S-adenosylmetionin, vilket gör dem enklare att använda. De kräver endast Mg2+ joner som kofaktorer. Dessa enzymer är platsspecifika eftersom de hydrolyserar specifika fosfodiesterbindningar i båda DNA-strängarna. Klass II -restriktionsendonukleaser används i allmänhet som nyckelmaterialet inom molekylärbiologi och rekombinanta DNA -tekniker, inklusive genomkartläggning, RFLP -analys, DNA -sekvensering och kloning.

Enzymer av typ III:- Precis som klass I -enzymer har typ III -enzymer både restriktions- och modifieringsaktiviteter. De känner igen specifika sekvenser och klyver 25 - 27 baspar utanför igenkänningssekvensen, i en 3 & akut riktning. De kräver Mg2+-joner för sin aktivitet.

Enzymer av typ II, har liknande kofaktorer och makromolekylär struktur som de för typ II-system, begränsar det faktum att restriktion sker på avstånd från igenkänningsstället deras användbarhet.


Typ II-restriktionsendonukleaser-ett historiskt perspektiv med mera

Den här artikeln fortsätter serien med undersökningar och sammanfattningar om restriktionsendonukleaser (REaser) som påbörjades i år inom Nucleic Acids Research. Här diskuterar vi 'Typ II' REaser, den typ som används för DNA-analys och kloning. Vi fokuserar på deras biokemi: vad de är, vad de gör och hur de gör det. Typ II REaser produceras av prokaryoter för att bekämpa bakteriofager. Med extrem noggrannhet känner var och en av en viss sekvens i dubbelsträngat DNA och klyver vid en fast position inom eller i närheten. Upptäckten av dessa enzymer på 1970-talet, och användningen av dem, har sedan dess påverkat varje hörn av biovetenskapen. De blev de möjliggörande verktygen för molekylärbiologi, genetik och bioteknik och analyserade på de mest grundläggande nivåerna. Hundratals olika REaser har upptäckts och är tillgängliga kommersiellt. Deras gener har klonats, sekvenserats och överuttryckts. De flesta har karakteriserats till viss del, men få har studerats på djupet. Här beskriver vi de ursprungliga upptäckterna inom detta område och egenskaperna hos de första undersökta REaserna av typ II. Vi diskuterar mekanismerna för sekvensigenkänning och katalys, och de olika oligomera sätten i vilka typ II REaser verkar. Vi beskriver den överraskande heterogeniteten som avslöjas genom jämförelser av deras sekvenser och strukturer.

© The Author(s) 2014. Publicerad av Oxford University Press på uppdrag av Nucleic Acids Research.

Siffror

Antal publikationer för EcoRI ...

Antal publikationer för EcoRI och EcoRV per år från 1972 till 2012.…

Hamilton Smith och Daniel Nathans...

Hamilton Smith och Daniel Nathans vid Nobelprisets presskonferens den 12 oktober ...

Schematisk illustration av stegen ...

Schematisk illustration av stegen involverade i DNA-igenkänning och klyvning av REaser...

Samkristallstrukturer med specifik begränsning ...

Samkristallstrukturer av specifika restriktionsenzym-DNA-komplex bestämda mellan 1990 och 1999.

Schematisk framställning av interaktionen ...

Schematisk framställning av EcoRI: s interaktion med dess igenkänningssekvens. För tydlighets skull,…

Schematisk framställning av interaktionen ...

Schematisk representation av interaktionen mellan EcoRV och dess igenkänningssekvens. Interaktioner med…

En allmän mekanism för DNA...

En allmän mekanism för DNA-klyvning av EcoRI och EcoRV. Ett aktiverat vatten ...

Den aktiva sidan (PD…D/ExK) för…

Den aktiva platsen (PD… D/ExK) för EcoRI och EcoRV.

Ett exempel på ett REase-katalytiskt ställe (Mval, pdb: 2OAA). Det nukleofila vattnet ...

Alternativa mekanismer för fosforylöverföring...

Alternativa mekanismer för fosforylöverföringsreaktioner: associativ (överst) och dissociativ (botten). Mekanismerna...

Jämförelse av de aktiva webbplatserna ...

Jämförelse av de aktiva platserna för två strukturellt mycket liknande restriktionsenzymer BglII ...

Underenhetens sammansättning och klyvning ...

Underenhetens sammansättning och klyvningsmekanism för utvalda undertyper av typ II -reaser ...

Sätt för DNA -bindning av zinkfingerproteiner: varje finger känner igen cirka tre ...