Information

Vilka kryogena injektionsflaskor och lock är idealiska för lagring av glycerolförråd?

Vilka kryogena injektionsflaskor och lock är idealiska för lagring av glycerolförråd?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Det finns invändigt gängade, utvändigt gängade, naturliga kåpor. Till flaskorna finns kjolar, stjärnfot och olika underdelar. Varför spelar någon av dessa saker någon roll?


För alla typer av frysta cellförråd (för cellodling eller bakterier) använder vi rutinmässigt frysande injektionsflaskor som liknar dessa: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&N4=V9255%7CSIGMA&N25 = 0 & QS = ON & F = SPEC

Dessa rör är invändigt gängade med en gummigenomföring för att täta locket och göra röret luft- och vattentätt. Jag misstänker att den lufttäta tätningen förhindrar att kondens kommer in i röret och fryser i röret, men jag har aldrig haft problem med något av rören.

Rören spelar egentligen ingen roll vid -80 C för ett glycerolstick. Frysning av celler i flytande kväve har däremot en enorm inverkan vid lagring i flytande kväve. Vissa rör är avsedda att lagras i vätskan kontra ångfasen av kväve och inte matcha röret till det avsedda lagringsförhållandet kan resultera i explosion av röret.


Frysa celler

Cellinjer i kontinuerlig kultur kommer sannolikt att drabbas av oönskade resultat som genetisk drift, åldrande och mikrobiell kontaminering, och även de bäst drivna laboratorierna kan uppleva utrustningsfel. En etablerad cellinje är en värdefull resurs och ersättningen är dyr och tidskrävande. Därför är det mycket viktigt att de fryses ner och bevaras för långtidslagring. Ett välskött fryst cellbestånd är en viktig del av cellkulturen.

Så snart ett litet överskott av celler blir tillgängligt från subodling är den bästa konserveringsmetoden att hålla dem frysta som en fröbestånd, skyddad och inte göras tillgänglig för allmänt laboratoriebruk. Arbetslager kan beredas och fyllas på från frusna fröbestånd. Om fröbestånden blir uttömda kan kryokonserverade arbetsbestånd sedan tjäna som en källa för att förbereda ett färskt fröbestånd med en minsta ökning av generationens antal från den första frysningen.

Den allmänna frysmetoden är densamma för vidhäftande och suspensionsceller, förutom att vidhäftande celler måste avlägsnas från odlingsplattorna innan frysningsproceduren påbörjas. Den bästa metoden för att kryokonservera odlade celler är att lagra dem i flytande kväve i komplett medium i närvaro av ett kryoskyddande medel såsom dimetylsulfoxid (DMSO). Kryoskyddande medel minskar mediets fryspunkt och tillåter en långsammare kylhastighet, vilket minskar risken för iskristallbildning, vilket kan skada celler och orsaka celldöd.

Notera: En DMSO -lösning är känd för att underlätta inträdesprocessen för organiska molekyler i vävnader. Hantera reagenser som innehåller DMSO med hjälp av utrustning och metoder som är lämpliga för farorna med sådana material. Kassera reagenserna i enlighet med lokala bestämmelser.

Frysmedel
Använd alltid det rekommenderade frysmediet för kryokonservering av dina celler. Frysmediet bör innehålla ett kryoskyddande medel såsom DMSO eller glycerol. Du kan också använda ett speciellt formulerat komplett kryokonserveringsmedium som Gibco Recovery Cell Culture Freezing Medium eller Gibco Synth-a-Freeze Cryopreservation Medium.

    är ett färdigt att använda fullständigt kryokonserveringsmedium för däggdjurscellkulturer, som innehåller ett optimerat förhållande av fetalt bovint serum till nötkreativt serum för förbättrad cellviabilitet och cellåterhämtning efter upptining. är ett kemiskt definierat, proteinfritt, sterilt kryokonserveringsmedium innehållande 10% DMSO som är lämpligt för kryokonservering av många stam- och primära celltyper med undantag av melanocyter.

Vilka kryogena injektionsflaskor och lock är idealiska för lagring av glycerolförråd? - Biologi

  • Effektivt underhåll av stamkulturer är avgörande för kvalitetskontroll, metodvalidering och forskningsändamål
  • Upprepad subodling kan så småningom leda till kontaminering, förlust av livskraft och genotypiska/fenotypiska förändringar
  • Frystorkning och kryogen lagring är att föredra, men kanske inte praktiskt för mindre laboratorier
  • Cryoprotectant -pärlor tillåter rutinmässiga laboratorier att hålla en lagerodlingssamling enkelt och till låg kostnad.

En av de viktigaste, men ofta försummade, uppgifterna i alla rutinmässiga mikrobiologiska laboratorier är att upprätthålla en samling av bakterie- och svampkulturer. I ett hektiskt laboratorium är det alldeles för lätt för odlingssamlingen att försämras till ett virvar av dåligt märkta, delvis uttorkade agar-snedställda kulturer på baksidan av ett kylskåp. Men det behöver inte vara så, och det ska det inte vara.

Det finns flera anledningar till varför ett mikrobiologiskt laboratorium behöver stamkulturer i gott skick. Den typiska stockkultursamlingen kan innehålla isolat som faller i en eller flera av följande kategorier:

  • Referensstammar för kvalitetskontroll av odlingsmedier och metoder
  • Isolat som används vid beredning av inokulerade prover och prover för kvalitetskontroll och utbildningsändamål
  • Referensstammar för utveckling och validering av nya metoder
  • Patogener och förstöringsorganismer som ligger under rutinmässiga tester eller vid utredning av kontamineringsproblem
  • Kulturer som används i mikrobiologiska analyser
  • Isolat som krävs för forskningsändamål

Det är svårt att tänka sig ett laboratorium som inte behöver beståndskulturer av minst en av dessa skäl, även om det bara handlar om att behålla några referensstammar för QC -ändamål.

Metoder för att upprätta och underhålla en kultursamling

  • Risk för kontaminering - med tiden är det möjligt för viktiga isolat att växa helt över av föroreningar
  • Förlust av livskraft - om subodling inte utförs med erforderliga intervall och kulturerna lagras otillräckligt kan känsliga isolat förlora livskraft och vara oåterkalleliga
  • Fortsatt tillväxt vid kyla temperaturer - vissa organismer, som t.ex. Listeria monocytogenes, kan långsam tillväxt vid 0 o C eller ännu mindre
  • Märkningsmisstag – subodling av ett stort antal agarlutningar många gånger introducerar en betydande chans att en kultur blir felaktigt märkt
  • Genetisk drift och mutation – varje subkultur har en potential för genotypiska och fenotypiska förändringar, såsom förlust av virulens och resistensfaktorer, eller minskad motilitet.

Av detta är det tydligt att om inte stamkulturer underhålls noggrant kan de orsaka allvarliga problem i laboratoriet och även en väl underhållen samling kan ge missvisande resultat i tid. Faktum är att American Type Culture Collection (ATCC) rekommenderar att högst fem passager (subkulturer) inte ska göras från den ursprungliga typstammen, varvid den första passagen definieras som kulturen framställd från flaskan som levereras av ATCC.

Alternativa metoder Lyckligtvis är laboratorierna inte begränsade till den traditionella agar -snedbeståndskulturen i dessa dagar, och det finns andra metoder tillgängliga för att underlätta insamlingsprocessen och för att övervinna problemen som beskrivs ovan.

Frystorka Även känd som lyofilisering, frystorkning är en metod som kan användas för att avbryta metabolismen av bakterie- och svampkulturer och för att stabilisera dem för långtidslagring.

En tjock suspension av bakterieceller eller svampsporer framställs först i ett lämpligt suspensionsmedium, såsom 10% skummjölk, eller en specifik lyofilisationsbuffert. Denna suspension fördelas sedan i små glasflaskor och fryses. När de har frysts placeras de pluggade eller löst förslutna injektionsflaskorna i torkningskammaren i en frystork och torkas under vakuum i 2 - 24 timmar för att avlägsna vatten i fryst tillstånd. Ett sekundärt torksteg kan också tillämpas genom att fästa flaskorna på frystorkens fördelare i ytterligare 2 – 12 timmar. När torkningen är klar försluts flaskan och förvaras sedan mörkt vid 8 o C eller lägre.

Många bakterie- och svamparter kommer att förbli stabila och livskraftiga i minst ett år under dessa förhållanden och i vissa fall har kulturer framgångsrikt återupplivats många år senare. Vissa kräsna eller känsliga arter kan dock skadas av processen eller kanske inte förbli livskraftiga. Till exempel cellerna i Campylobacter spp och mögel som producerar stora ömtåliga sporer kräver noggrann hantering eftersom de är mycket känsliga för skador och bara kan lagras under kortare perioder.

Frystorkning är den föredragna metoden för att hålla referensstammar och andra isolat under långa perioder och är standardpraxis för stora kommersiella och nationella kultursamlingar. Många kultursamlingar levererar frystorkade kulturer till laboratorier i glasflaskor, men det är också möjligt att få några QC-stammar i lätta att öppna behållare som inkluderar hydratiseringsmedier och en ymppinne för att förenkla återupplivning och subkultur.

Frystorkning lämpar sig förmodligen inte för mindre laboratorier som bara behöver upprätthålla en liten stamkultursamling. Förutom behovet av kostsam frystorkningsutrustning är processen tidskrävande och kräver kunnig personal för att säkerställa att ingen kontaminering inträffar.

Kryogen lagring En alternativ metod för att lagra kulturer under förhållanden som avbryter ämnesomsättningen är så kallad kryogen lagring, vanligtvis med flytande kväve. Suspensioner av bakterieceller eller svampsporer framställs i ett kryoskyddande medium, som vanligtvis innehåller 10-15% glycerol för att minimera skador under frysning. Suspensionen dispenseras sedan i lämpliga behållare, såsom små flaskor med skruvförslutning, som sedan sänks ned i eller suspenderas ovanför flytande kväve.

Temperaturen för flytande kväve är -196 o C, långt under den temperatur vid vilken all metabolisk aktivitet antas upphöra. Som med frystorkning kommer inte alla mikrobiella kulturer att överleva processen, men de som gör det kan överleva i många år. Visserligen kan livsduglighet för vissa isolat vara bättre än för frystorkade kulturer. Kryogen lagring är dock dyr, kräver betydande mängder flytande kväve och är troligen endast lämplig för större referenslaboratorier med omfattande kultursamlingar.

Fryst lagring på kryoskyddande pärlor Kanske är den mest praktiska metoden för långvarig lagring av mikrobiella förrådskulturer för mindre laboratorier och de som utför rutinmässiga tester att frysa kulturer på porösa pärlor som är utformade för att låta celler och sporer att fästa vid ytan - vilket ger en viss grad av skydd mot skador vid frysning.

Det finns ett antal lättillgängliga kommersiella produkter som laboratorier kan använda för att göra detta, men alla fungerar på ungefär samma sätt.

Dispositionsmetod 1. Förbered en suspension av celler eller sporer av isolatet som ska lagras, helst med en 18 till 24 timmar gammal kultur odlad på fast medium. Den koloniala tillväxten suspenderas i en kryoskyddande vätska, såsom Brucella Buljong med glycerol, i en kryogen injektionsflaska innehållande 20-30 av de porösa pärlorna.

2. Suspensionen blandas genom inversion och får sedan stå vid rumstemperatur i 15-20 minuter. Under denna period kommer ett cellskikt att fästa vid de porösa pärlorna, som har ett stort förhållande yta till volym.

3. Överskottet av kryoskyddande vätska avlägsnas sedan genom aspiration och flaskan överförs omedelbart till en frys, helst vid -70 o C eller lägre (även om pärlorna kan hållas vid -20 o C, kommer de att förlora viabilitet snabbare än vid lägre temperaturer ). De kryogena injektionsflaskorna kan förvaras i aluminiumkryoblocker för att förhindra snabb upptining när de tas ut från frysen.

4. För att återuppliva en kultur, ta bort en enda pärla snabbt och använd den för att inokulera ett fast, icke-selektivt medium. Injektionsflaskan ska återförslutas och återföras till frysen omedelbart så att resten av kulturen inte får tina.

Denna metod tillåter stabila stamkulturer att hållas under längre perioder, förutsatt att temperaturen hålls vid -70 o C eller lägre. Kulturerna är också mindre känsliga för kontaminering. Ingen specialiserad eller dyr utrustning krävs och därför är metoden lämplig för små rutinlaboratorier. Användningen av porösa pärlor gör det också möjligt för laboratorier att bättre utnyttja frystorkade referenskulturer som erhållits från stora samlingar och minskar behovet av frekvent utbyte. Andra överväganden Korrekt märkning är en viktig del för att upprätthålla alla lager kultursamlingar. Kryogena flaskor är vanligtvis utformade för märkning med permanenta tuschpennor och finns även med färgkodade toppar för att hjälpa laboratorier att identifiera särskilda kategorier av kulturer.

Ackrediterade laboratorier kommer normalt att behöva föra register över underhållet av sina lagerodlingar där de används för QC och valideringsändamål. Det kan hjälpa till att förbereda specifik dokumentation för detta, men grundläggande datorark och mer specialiserade laboratorieprogram kan också användas. Det är viktigt att logga varje subkultur av alla beståndskulturer så att samlingen kan hållas i gott skick och bytas ut vid behov.

Outsourcing För laboratorier med omfattande stamkultursamlingar, kanske inklusive unika stammar isolerade från patienter, miljön eller bortskämda produkter, kan det vara bra att låta ett specialiserat referenslaboratorium hjälpa till att underhålla samlingen. Flera kommersiella kultursamlingar erbjuder specialiserade frystorkningstjänster och kommer också att lagra viktiga kulturer för kunderna. Detta kan vara avgörande om laboratoriesamlingens integritet äventyras av en händelse som en defekt frys.

Få de senaste uppdateringarna i snabba mikrobiologiska testmetoder skickade till din e -post? Prenumerera på gratis eNewsletter för snabbmikrobiologi


Innehåll

Vattenbjörnar (Tardigrada), mikroskopiska flercelliga organismer, kan överleva frysning genom att ersätta det mesta av deras inre vatten med sockertrehalosen, vilket förhindrar kristallisering som annars skadar cellmembranen. Blandningar av lösta ämnen kan uppnå liknande effekter. Vissa lösta ämnen, inklusive salter, har nackdelen att de kan vara giftiga vid intensiva koncentrationer. Förutom vattenbjörnen tål skogsgrodor att deras blod och andra vävnader fryser. Urea ackumuleras i vävnader som förberedelse för övervintring och leverglykogen omvandlas i stora mängder till glukos som svar på inre isbildning. Både urea och glukos fungerar som "kryoskyddsmedel" för att begränsa mängden is som bildas och för att minska osmotisk krympning av celler. Grodor kan överleva många frys-/tiningshändelser under vintern om inte mer än cirka 65 % av det totala kroppsvattnet fryser. Forskning som undersöker fenomenet "frysande grodor" har framför allt utförts av den kanadensiska forskaren, Dr. Kenneth B. Storey. [ citat behövs ]

Frystolerans, där organismer överlever vintern genom att frysa fasta och upphöra med livsfunktioner, är känd hos ett fåtal ryggradsdjur: fem arter av grodor (Rana sylvatica, Pseudacris triseriata, Hyla crucifer, Hyla versicolor, Hyla chrysoscelis), en av salamandrar (Salamandrella keyserlingii), en av ormar (Thamnophis sirtalis) och tre sköldpaddor (Chrysemys picta, Terrapene carolina, Terrapene ornata). [3] Snäppande sköldpaddor Chelydra serpentina och väggödlor Podarcis muralis överlever också nominell frysning men det har inte fastställts för att vara anpassningsbart för övervintring. I fallet med Rana sylvatica en kryokonserveringsmedel är vanlig glukos, som ökar i koncentration med cirka 19 mmol/l när grodorna kyls långsamt. [3]

En tidig teoretiker för kryokonservering var James Lovelock. År 1953 föreslog han att skador på röda blodkroppar under frysning berodde på osmotisk stress [4] och att ökad saltkoncentration i en uttorkande cell kan skada den. [5] [6] I mitten av 1950-talet experimenterade han med kryokonservering av gnagare och bestämde att hamstrar kunde frysas med 60% av vattnet i hjärnan kristalliserat till is utan några negativa effekter som andra organ visade sig vara mottagliga för skada. [7]

Kryokonservering tillämpades på mänskliga material från och med 1954 med tre graviditeter som ett resultat av insemination av tidigare frusna spermier. [8] Hönssperma kryokonserverades 1957 av ett team av vetenskapsmän i Storbritannien under ledning av Christopher Polge. [9] Under 1963 visade Peter Mazur, vid Oak Ridge National Laboratory i USA, att dödlig intracellulär frysning kunde undvikas om kylningen var tillräckligt långsam för att tillräckligt med vatten skulle kunna lämna cellen under progressiv frysning av den extracellulära vätskan. Denna hastighet skiljer sig mellan celler med olika storlek och vattenpermeabilitet: en typisk kylhastighet runt 1 ° C/minut är lämplig för många däggdjursceller efter behandling med kryoskyddande medel som glycerol eller dimetylsulfoxid, men hastigheten är inte ett universellt optimalt. [10]

Den 22 april 1966 frystes den första människokroppen – fastän den hade balsamerats i två månader – genom att den placerades i flytande kväve och förvarades strax över fryspunkten. Den äldre kvinnan från Los Angeles, vars namn är okänt, tinades snart ut och begravdes av släktingar. Den första människokroppen som frystes med hopp om framtida väckelse var James Bedfords, några timmar efter hans cancerframkallade död 1967. [11] Bedford är den enda cryonics-patienten som frystes före 1974 som fortfarande finns kvar idag. [12]

Lagring vid mycket låga temperaturer antas ge cellerna en obestämd livslängd, även om det faktiska effektiva livet är ganska svårt att bevisa. Forskare som experimenterade med torkade frön fann att det fanns en märkbar variation av försämring när prover förvarades vid olika temperaturer-även extremt kalla temperaturer. Temperaturer som är lägre än glasövergångspunkten (Tg) för polyols vattenlösningar, runt −136 °C (137 K −213 °F), tycks accepteras som intervallet där den biologiska aktiviteten avtar mycket, och −196 °C (77) K −321 °F), kokpunkten för flytande kväve, är den föredragna temperaturen för att lagra viktiga prover. Medan kylskåp, frysar och extra kalla frysar används för många föremål, krävs i allmänhet ultrakylning av flytande kväve för framgångsrik bevarande av de mer komplexa biologiska strukturerna för att praktiskt taget stoppa all biologisk aktivitet.

Fenomen som kan orsaka skador på celler under kryokonservering sker huvudsakligen under frysningsstadiet och inkluderar lösningseffekter, extracellulär isbildning, uttorkning och intracellulär isbildning. Många av dessa effekter kan minskas av kryoskyddsmedel. När det bevarade materialet har frusit är det relativt säkert från ytterligare skador. [13]

Lösningseffekter När iskristaller växer i iskallt vatten utesluts lösta ämnen, vilket gör att de koncentreras i det återstående flytande vattnet. Höga koncentrationer av vissa lösta ämnen kan vara mycket skadliga. Extracellulär isbildning När vävnader kyls långsamt migrerar vatten ut ur cellerna och is bildas i det extracellulära utrymmet. För mycket extracellulär is kan orsaka mekanisk skada på cellmembranet på grund av krossning. Uttorkning Migration av vatten, vilket orsakar extracellulär isbildning, kan också orsaka cellulär uttorkning. De associerade påfrestningarna på cellen kan orsaka skador direkt. Intracellulär isbildning Medan vissa organismer och vävnader kan tolerera en del extracellulär is, är all märkbar intracellulär is nästan alltid dödlig för celler.

De viktigaste teknikerna för att förhindra kryokonserveringsskador är en väletablerad kombination av kontrollerad hastighet och långsam frysning och en nyare flashfrysningsprocess som kallas förglasning.

Långsam programmerbar frysning Redigera

Kontrollerad hastighet och långsam frysning, också känd som långsam programmerbar frysning (SPF), [14] är en uppsättning väletablerade tekniker som utvecklats under början av 1970 -talet som möjliggjorde den första mänskliga embryot frusna Zoe Leyland under 1984. Sedan dess har maskiner som fryser biologiska prover med programmerbara sekvenser eller kontrollerade hastigheter använts överallt världen för människa, djur och cellbiologi - "fryser ner" ett prov för att bättre bevara det för eventuell upptining innan det fryses eller kryokonserveras i flytande kväve. Sådana maskiner används för frysning av oocyter, hud, blodprodukter, embryon, spermier, stamceller och allmän vävnadsbevarande på sjukhus, veterinärmedicinska och forskningslaboratorier runt om i världen. Som ett exempel uppskattas antalet levande födslar från frysta embryon "långfrusna" till cirka 300 000 till 400 000 eller 20 % av de uppskattade 3 miljoner in vitro-fertilisering (IVF) födslar. [15]

Dödlig intracellulär frysning kan undvikas om kylningen är tillräckligt långsam för att tillåta tillräckligt med vatten att lämna cellen under progressiv frysning av den extracellulära vätskan. För att minimera tillväxten av extracellulära iskristaller och omkristallisation, [16] kan biomaterial som alginater, polyvinylalkohol eller kitosan användas för att hindra iskristalltillväxt tillsammans med traditionella småmolekylära kryoskyddsmedel. [2] Den hastigheten skiljer sig mellan celler med olika storlek och vattenpermeabilitet: en typisk kylhastighet på cirka 1 ° C/minut är lämplig för många däggdjursceller efter behandling med kryoskyddande medel som glycerol eller dimetylsulfoxid, men hastigheten är inte universell optimalt. Hastigheten 1 ° C / minut kan uppnås genom att använda enheter som en hastighetsstyrd frys eller en bärbar frysbehållare. [17]

Flera oberoende studier har visat att frysta embryon som lagras med långsam frysningsteknik på vissa sätt kan vara "bättre" än färska i IVF. Studierna indikerar att användning av frysta embryon och ägg snarare än färska embryon och ägg minskade risken för dödfödsel och för tidig förlossning, även om de exakta orsakerna fortfarande undersöks.

Vitrifiering Redigera

Forskarna Greg Fahy och William F. Rall hjälpte till att införa vitrifiering till reproduktiv kryokonservering i mitten av 1980-talet. [18] Från och med 2000 hävdar forskare att vitrifiering ger fördelarna med kryokonservering utan skada på grund av iskristallbildning. [19] Situationen blev mer komplex med utvecklingen av vävnadsteknik eftersom både celler och biomaterial måste förbli isfria för att bevara hög cellviabilitet och funktioner, konstruktioners integritet och biomaterials struktur. Förglasning av vävnadskonstruerade konstruktioner rapporterades först av Lilia Kuleshova, [20] som också var den första vetenskapsmannen som uppnådde förglasning av oocyter, vilket resulterade i levande födsel 1999. [21] För klinisk kryokonservering kräver förglasning vanligtvis tillsats av kryoskyddsmedel före kyl. Kryoprotektanter är makromolekyler som tillsätts till frysmediet för att skydda cellerna från de skadliga effekterna av intracellulär iskristallbildning eller från lösningseffekterna under frysning och upptining. De tillåter en högre grad av cellöverlevnad under frysning, för att sänka fryspunkten, för att skydda cellmembranet mot frysrelaterad skada. Kryoskyddande medel har hög löslighet, låg toxicitet vid höga koncentrationer, låg molekylvikt och förmågan att interagera med vatten via vätebindning.

I stället för att kristallisera blir den sirapslösningen en amorf is - den vitrifierar. I stället för en fasförändring från vätska till fast material genom kristallisation är det amorfa tillståndet som en "fast vätska", och transformationen sker över ett litet temperaturintervall som beskrivs som "glasövergång" -temperaturen.

Vitrifiering av vatten främjas av snabb kylning och kan uppnås utan kryoskydd genom en extremt snabb temperaturminskning (megakelvin per sekund). Den hastighet som krävs för att uppnå glasartat tillstånd i rent vatten ansågs vara omöjligt fram till 2005. [22]

Två förhållanden som vanligtvis krävs för att tillåta förglasning är en ökning av viskositeten och en minskning av frysningstemperaturen. Många lösta ämnen gör båda, men större molekyler har i allmänhet en större effekt, särskilt på viskositeten. Snabb kylning främjar också förglasning.

För etablerade metoder för kryokonservering måste det lösta ämnet tränga in i cellmembranet för att uppnå ökad viskositet och minska frysningstemperaturen inuti cellen. Socker tränger inte lätt genom membranet. De lösta ämnen som gör det, såsom dimetylsulfoxid, ett vanligt kryoskyddande medel, är ofta giftiga i intensiv koncentration. En av de svåra kompromisserna med förglasande kryokonservering gäller att begränsa skadan som produceras av kryoskyddsmedlet självt på grund av kryoskyddsmedelstoxicitet. Blandningar av kryoskyddande medel och användning av isblockerare har gjort det möjligt för företaget Twenty-First Century Medicine att förglasa en kaninjure till −135 ° C med sin egen vitrifikationsblandning. Vid återuppvärmning transplanterades njuren framgångsrikt till en kanin, med fullständig funktionalitet och livsduglighet, som kunde upprätthålla kaninen på obestämd tid som den enda fungerande njuren. [23]

Persufflation Redigera

Blod kan ersättas med inerta ädelgaser och/eller metaboliskt vitala gaser som syre, så att organ kan svalna snabbare och mindre frostskyddsmedel behövs. Eftersom vävnadsområden separeras med gas, ackumuleras inte små expansioner och skyddar därmed mot krossning. [24] Ett litet företag, Arigos Biomedical, "har redan återhämtat grishjärtan från 120 minusgrader", [25] även om definitionen av "återhämtad" inte är klar. Tryck på 60 atm kan bidra till att öka värmeväxlingshastigheterna. [26] Gasformig perfusion/persufflation kan förbättra organkonservering i förhållande till statisk kylförvaring eller hypotermisk maskinperfusion, eftersom gasernas lägre viskositet kan hjälpa till att nå fler regioner av bevarade organ och leverera mer syre per gram vävnad. [27]

I allmänhet är kryokonservering enklare för tunna prover och suspenderade celler, eftersom dessa kan kylas snabbare och kräver därför mindre doser av giftiga kryoskyddande medel. Därför är kryokonservering av mänskliga lever och hjärtan för lagring och transplantation fortfarande opraktiskt.

Ändå möjliggör lämpliga kombinationer av kryoskyddande medel och regleringar för kylning och sköljning under uppvärmning ofta framgångsrik kryokonservering av biologiska material, särskilt cellsuspensioner eller tunna vävnadsprover. Exempel inkluderar:

    i spermakryokonservering
    • Särskilda celler för transfusion som trombocyter (trombosomer av Cellphire). Den är optimal vid hög koncentration av syntetiskt serum, stegvis jämvikt och långsam kylning. [28] i en blodtrådsbank

    Embryon Redigera

    Kryokonservering för embryon används för embryolagring, t.ex. när in vitro -fertilisering (IVF) har resulterat i fler embryon än vad som för närvarande behövs.

    En graviditet och resulterande frisk födelse har rapporterats från ett embryo som lagrats i 27 år efter framgångsrik graviditet av ett embryo från samma parti tre år tidigare. [30] Många studier har utvärderat barn födda från frysta embryon, eller "frost". Resultatet har varit jämnt positivt utan ökning av fosterskador eller utvecklingsavvikelser. [31] En studie av mer än 11 ​​000 kryokonserverade mänskliga embryon visade ingen signifikant effekt av lagringstid på överlevnad efter upptiningen för IVF- eller äggdonationscykler, eller för embryon frusna vid pronukleära eller klyvningsstadier. [32] Dessutom har lagringstiden inte haft någon signifikant effekt på klinisk graviditet, missfall, implantation eller levande födelsetal, vare sig från IVF- eller äggdonationscykler. [32] Snarare är oocyternas ålder, överlevnadsandel och antalet överförda embryon prediktorer för graviditetsresultatet. [32]

    Äggstocksvävnad Redigera

    Kryokonservering av äggstocksvävnad är av intresse för kvinnor som vill bevara sin reproduktionsfunktion bortom den naturliga gränsen, eller vars reproduktiva potential hotas av cancerterapi, [33] till exempel vid hematologiska maligniteter eller bröstcancer. [34] Förfarandet är att ta en del av äggstocken och utföra långsam frysning innan den lagras i flytande kväve medan behandlingen pågår. Vävnad kan sedan tinas upp och implanteras nära äggledaren, antingen ortotopiskt (på den naturliga platsen) eller heterotopiskt (på bukväggen), [34] där det börjar producera nya ägg, vilket tillåter normal befruktning. [35] Äggstocksvävnaden kan också transplanteras till möss som är immunkompromitterade (SCID -möss) för att undvika transplantatavstötning och vävnad kan skördas senare när mogna folliklar har utvecklats. [36]

    Oocyter Redigera

    Människo -oocytkryokonservering är en ny teknik där en kvinnas ägg (oocyter) extraheras, fryses och lagras. Senare, när hon är redo att bli gravid, kan äggen tinas, befruktas och överföras till livmodern som embryon. Sedan 1999, när födelsen av det första barnet från ett embryo som härrörde från förglasade uppvärmda kvinnas ägg rapporterades av Kuleshova och medarbetare i tidskriften Human Reproduction, [20] har detta koncept blivit erkänt och utbrett. Detta genombrott för att uppnå vitrifiering av en kvinnas oocyter gjorde ett viktigt framsteg i vår kunskap och praktik om IVF -processen, eftersom den kliniska graviditetsfrekvensen är fyra gånger högre efter äggförglasning än efter långsam frysning. [37] Oocytförglasning är avgörande för att bevara fertiliteten hos unga onkologipatienter och för individer som genomgår IVF som av antingen religiösa eller etiska skäl motsätter sig att frysa embryon.

    Spermaredigering

    Sperma kan användas framgångsrikt nästan på obestämd tid efter kryokonservering. Den längsta rapporterade framgångsrika lagringen är 22 år. [38] Den kan användas för spermadonation där mottagaren vill ha behandlingen på en annan tid eller annan plats eller som ett sätt att bevara fertiliteten för män som genomgår vasektomi eller behandlingar som kan äventyra deras fertilitet, t.ex. kemoterapi, strålbehandling eller kirurgi.

    Testikelvävnad Redigera

    Kryokonservering av omogen testikelvävnad är en utvecklingsmetod för att använda reproduktion till unga pojkar som behöver gonadotoxisk behandling. Djurdata är lovande eftersom friska avkommor har erhållits efter transplantation av frusna testikelcellsuspensioner eller vävnadsbitar. Inga av fertilitetsåterställningsalternativen från frusen vävnad, dvs cellsuspensionstransplantation, vävnadstransplantation och in vitro -mognad (IVM) har ännu visat sig vara effektiva och säkra hos människor. [39]

    Moss Edit

    Kryokonservering av hela mossväxter, särskilt Physcomitrella patens, har utvecklats av Ralf Reski och medarbetare [40] och utförs på International Moss Stock Center. Denna biobank samlar, bevarar och distribuerar mossmutanter och mossekotyper. [41]

    Mesenkymala stromaceller (MSC) Redigera

    MSC, om de transfunderas omedelbart inom några timmar efter upptining, kan visa nedsatt funktion eller visa minskad effekt vid behandling av sjukdomar jämfört med de MSC som är i logfas av celltillväxt (färsk). Som ett resultat bör kryokonserverade MSC återföras till logfasen för celltillväxt in vitro kultur innan dessa administreras för kliniska prövningar eller experimentella terapier. Återodling av MSC:er hjälper till att återhämta sig från den chock som cellerna får under frysning och upptining. Olika kliniska prövningar på MSC har misslyckats som använde kryokonserverade produkter omedelbart efter upptining jämfört med de kliniska prövningar som använde färska MSC. [42]

    Bacteria and fungi can be kept short-term (months to about a year, depending) refrigerated, however, cell division and metabolism is not completely arrested and thus is not an optimal option for long-term storage (years) or to preserve cultures genetically or phenotypically, as cell divisions can lead to mutations or sub-culturing can cause phenotypic changes. A preferred option, species-dependent, is cryopreservation. Nematode worms are the only multicellular eukaryotes that have been shown to survive cryopreservation. [43] Shatilovich AV, Tchesunov AV, Neretina TV, Grabarnik IP, Gubin SV, Vishnivetskaya TA, Onstott TC, Rivkina EM (May 2018). "Viable Nematodes from Late Pleistocene Permafrost of the Kolyma River Lowland". Doklady Biological Sciences. 480 (1): 100–102. doi:10.1134/S0012496618030079. PMID 30009350. S2CID 49743808.

    Fungi Edit

    Fungi, notably zygomycetes, ascomycetes, and higher basidiomycetes, regardless of sporulation, are able to be stored in liquid nitrogen or deep-frozen. Cryopreservation is a hallmark method for fungi that do not sporulate (otherwise other preservation methods for spores can be used at lower costs and ease), sporulate but have delicate spores (large or freeze-dry sensitive), are pathogenic (dangerous to keep metabolically active fungus) or are to be used for genetic stocks (ideally to have an identical composition as the original deposit). As with many other organisms, cryoprotectants like DMSO or glycerol (e.g. filamentous fungi 10% glycerol or yeast 20% glycerol) are used. Differences between choosing cryoprotectants are species (or class) dependent, but generally for fungi penetrating cryoprotectants like DMSO, glycerol or polyethylene glycol are most effective (other non-penetrating ones include sugars mannitol, sorbitol, dextran, etc.). Freeze-thaw repetition is not recommended as it can decrease viability. Back-up deep-freezers or liquid nitrogen storage sites are recommended. Multiple protocols for freezing are summarized below (each uses screw-cap polypropylene cryotubes): [44]

    Bacteria Edit

    Many common culturable laboratory strains are deep-frozen to preserve genetically and phenotypically stable, long-term stocks. [45] Sub-culturing and prolonged refrigerated samples may lead to loss of plasmid(s) or mutations. Common final glycerol percentages are 15, 20, and 25. From a fresh culture plate, one single colony of interest is chosen and liquid culture is made. From the liquid culture, the medium is directly mixed with an equal amount of glycerol the colony should be checked for any defects like mutations. All antibiotics should be washed from the culture before long-term storage. Methods vary, but mixing can be done gently by inversion or rapidly by vortex and cooling can vary by either placing the cryotube directly at −50 to −95 °C, shock-freezing in liquid nitrogen or gradually cooling and then storing at −80 °C or cooler (liquid nitrogen or liquid nitrogen vapor). Recovery of bacteria can also vary, namely, if beads are stored within the tube then the few beads can be used to plate or the frozen stock can be scraped with a loop and then plated, however, since only little stock is needed the entire tube should never be completely thawed and repeated freeze-thaw should be avoided. 100% recovery is not feasible regardless of methodology. [46] [47] [48]

    Worms Edit

    The microscopic soil-dwelling nematode roundworms Panagrolaimus detritophagus and Plectus parvus are the only eukaryotic organisms that have been proven to be viable after long-term cryopreservation to date. In this case, the preservation was natural rather than artificial, due to permafrost.

    Vertebrates Edit

    Several animal species, including fish, amphibians, and reptiles have been shown to tolerate freezing. These species include at least four species of frogs (Pseudacris crucifer, Hyla versicolor, Pseudacris triseriata, Lithobates sylvaticus) and several species of turtles (Terrapene carolina, hatchling Chrysemys picta), lizards, and snakes are freeze tolerant and have developed adaptations for surviving freezing. While some frogs hibernate underground or in water, body temperatures still drop to −5 to −7 °C, causing them to freeze. De Wood frog (Lithobates sylvaticus) can withstand repeated freezing, during which about 65% of its extracellular fluid is converted to ice. [45]


    Preserving Microorganisms Using Microencapsulation?

    Microencapsulation, where cells are entrapped in a matrix prior to storage, has been proposed as a long term microbial preservation method which does not expose the microorganisms to the harsh stresses of freezing and drying. The matrix shields the cells and increases stability during storage. Microencapsulation of probiotic bacteria in calcium alginate has been shown to improve their viability when stored at -80°C. Electrospinning and electrospraying, where microorganisms are trapped in nanofibers and droplets respectively, have also been used to preserve the viability of sensitive probiotic bacteria [6].

    Microbial preservation techniques enable the viability of microorganisms to be maintained, paving the way for their potential to be explored for years to come. With the right methods, some of these microorganisms may still be around in freezers long after we are gone, waiting to be revived by future generations of researchers!


    INTRODUKTION

    Med hjälp av Kochs postulat för identifiering av patogena mikrober, identifierade Ogston det etiologiska medlet för suppurativa bölder (Ogston, 1883). Namnet Staphylococcus aureus valdes för att särskilja denna art med sitt karakteristiska gula kolonipigment från en annan stafylokockkommensal som bildar vita kolonier (Staphylococcus albus, nu utsedd Staphylococcus epidermidis) (Rosenbach, 1884 Götz et al., 2006). S. aureus uppvisar flera slående mikrobiologiska egenskaper, t.ex. binder mikroben immunglobuliner och agglutinerar med eller koagulerar blod och plasma (Loeb, 1903 Much, 1908 Forsgren och Sjöquist, 1966 Cheng et al., 2011). Dessa egenskaper har varit användbara för tidig och snabb diagnos av S. aureus infektioner (för en historisk redogörelse för koagulastestet, följ länken http://www.microbelibrary.org/index.php/library/laboratory-test/3220-coagulase-test-protocol).

    Allt Staphylococci växa i kluster, en funktion som kan visualiseras genom mikroskopi och står för det grekiska namnet σ τ α Φ υ λo κo κ κoς eller druvliknande bär. Klustering orsakas av ofullständig separation av dotterceller efter uppdelning i tre alternerande vinkelräta plan (Tzagoloff och Novick, 1977 Giesbrecht et al., 1998). S. aureus celler verkar perfekt sfäriska med en diameter på

    1 μm (Giesbrecht et al., 1998).S. aureus producerar också katalas när det appliceras på kolonimaterial, är katalastestet ett snabbt, användbart test för att skilja stafylokocker från andra grampositiva bakterier såsom streptokocker.

    S. aureus är en fakultativ anaerob som växer genom aerob andning eller genom jäsning, vilket huvudsakligen ger mjölksyra. Bakterien metaboliserar glukos via pentosfosfatvägen (Reizer et al., 1998). Det finns inga bevis för existensen av Entner-Doudoroff-vägen, men enzymer från hela trikarboxylsyracykeln och ett typiskt F0F1-ATPas kodas av genomet av S. aureus (Kuroda et al., 2001). Vid utarmning av glukos, S. aureus celler som växer under aeroba förhållanden oxiderar D-galaktos, acetat, succinat och malat. En utmärkt sammanfattning av dessa metaboliska vägar publicerades nyligen (G ötz et al., 2006).

    FÖRSIKTIGHET: S. aureus är en mycket virulent och anpassningsbar patogen med förmågan att infektera, invadera, bestå och replikera i vilken mänsklig vävnad som helst inklusive hud, ben, viscerala organ eller kärl (Lowy, 1998). Organismen har placerats i Riskgrupp Nivå 2. Alla manipulationer med S. aureus stammar måste utföras efter biosäkerhetsnivå 2 åtgärder inklusive experimentellt arbete i certifierade biosäkerhetsskåp. Riktlinjer för BSL2 -övning kan erhållas från den senaste versionen av Biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier (BMBL, 5:e upplagan) via följande CDC-webblänk: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/.


    Sidfot

    Information

    Övrig

    Avantor & reg, ett Fortune 500-företag, är en ledande global leverantör av verksamhetskritiska produkter och tjänster till kunder inom biopharma-, hälso- och sjukvård, utbildning och amp-regeringen samt avancerad teknik och amp-materialindustrin. Vår portfölj används i praktiskt taget alla led i de viktigaste forsknings-, utvecklings- och produktionsaktiviteterna inom de branscher vi tjänar. En av våra största styrkor kommer från att ha en global infrastruktur som är strategiskt placerad för att stödja våra kunders behov. Vårt globala fotavtryck gör att vi kan betjäna mer än 225 000 kundplatser och ger oss omfattande tillgång till forskningslaboratorier och forskare i mer än 180 länder. Vi satte igång vetenskapen för att skapa en bättre värld. För information besök www.avantorsciences.com och hitta oss på LinkedIn, Twitter och Facebook.

    & kopiera 2021 VWR International, LLC. Alla rättigheter förbehållna.
    & kopia 2021 FORTUNE Media IP Limited Alla rättigheter förbehållna. Använd under licens.

    Din version av Internet Explorer stöds inte av denna webbplats. Vi rekommenderar att du uppgraderar till Internet Explorer 11 eller annan webbläsare som stöds och kontrollerar om du använder IE11 i Kompatibilitetsvisningsläge.


    Representative Results

    Ett exempel av C. difficile grown on BHIS and Columbia anaerobic sheep blood agar media can be seen in figur 2. C. difficile forms irregular colonies that are flat and possess a ground-glass appearance which is evident on both media. Here, an erythromycin-sensitive clinical isolate of C. difficile, 630E 30 , is grown on BHIS agar, an enriched, non-selective medium, for 24 hr at 37 ଌ (Figure 2A). Colonies on Columbia anaerobic sheep blood agar appear similar to those grown on BHIS under white light (Figure 2B) however, the use of this medium also provides for detection of the greenish or chartreuse fluorescence exhibited by C. difficile under långvågigt ultraviolett (UV) ljus 15 (Figur 2C). C. difficile colonies on TCCFA agar look similar to growth on BHIS agar. Because of the presence of two antibiotics in TCCFA medium, a time period of 48 hr growth is necessary before enumerating colonies.

    Figure 1. The Coy Laboratories Type C vinyl chamber and its components. (A) A Coy Laboratories Type C vinyl chamber which provides workspace for a single individual at one time (42 in. x 32 in.). It contains a catalyst fan box (back left corner) which circulates and heats the air, and holds the Stak-Pak containing the palladium catalyst required to reduce any oxygen contamination. (B) The airlock serves as an interchange and provides a mechanism for the transfer of materials in and out of the chamber while preventing significant oxygen contamination within the anaerobic environment. Luftslussen har två dörrar: en ger tillgång till utsidan av luftslussen och den andra ger tillgång till det inre av den anaeroba kammaren. The airlock is programmable and allows for customized cycles for entry into the chamber. It is operable in automatic, semi-manual and manual modes. (C) Attached, flexible latex gloves are provided which allow full range of motion and reach within the chamber. The gloves are secured to a specialized cuff attached to the vinyl sleeves with vinyl adhesive, permitting replacement of gloves without disrupting the anaerobic atmosphere of the chamber. Neoprene gloves are also available. (D) The Model 10 Gas Analyzer continuously monitors both oxygen and hydrogen levels providing an instantaneous readout of the atmosphere within the chamber. This unit allows for immediate alerts if a leak occurs, an incorrect gas mix is used or additional problems arise via audible alarms and a flashing LED light.

    Figure 2. The appearance of C. difficile colonies on various media. The characteristic flat, irregular, ground-glass appearance is evident with an erythromycin-sensitive clinical isolate of C. difficile, 630E 30 , grown on BHIS agar for 24 hr (A) and Columbia anaerobic sheep blood agar for 48 hr under white light (B) and long wave ultraviolet light (C).


    What type of cryovial to use to preserve samples at -80C?

    So I'm processing 700 individual soil samples into a -80C freezer with the hope to do environmental DNA extraction on each sample using soil DNA extraction kits, about a month or two down the line.

    I've already stored many of the soil samples into the -80C freezer within this exact type of Cryovial (externally threaded)

    But it's come to my attention that cryovials also come in an internally threaded form, which looks like this: https://www.abcscientific.com/image/cache/data/globe/cryogenic-tube-3003-400x400.jpg

    I read that the internally threaded cryotubes are supposed to provide a better seal than the externally threaded cryotubes.

    I'm trying to prevent "freezer burn" or ice crystal formation within the tube. Does having internal thread vs. external thread style cryotubes make a big difference in how well the samples are preserved at -80C over months?

    Iɽ appreciate your thoughts. Thanks and have a good day!

    When I was working with mammalian cells, we only used internally threaded. I don't, however, know of why, or when one would be favored over the other - sorry#

    Externally threaded carry about 15-20% more volume for the same general size vial.

    If you're looking to prevent freezer burn, I think it's more important that they have an O-ring

    Yes, this is the biggest factor. The internal/external threads can make a different in cap size and fitting in a container, but the o-ring is what it's all about.

    i feel like this is one of those things i've used so many times but never really questioned or learned how/why it works. what exactly do cryovials and the O ring specifically do that standard snap cap tubes dont?

    We store our single-use glycerol stocks in Matrix tubes (https://www.matrixtechcorp.com/storage-systems/solutions.aspx?id=14) which are practical because they let you store them in 96 tube racks instead of boxes and you can open 8 at a time. They've got internal threads and an O-ring. Not sure whether theyɽ be better for your application, but they've worked a lot better for us.

    I very much doubt you would see any real difference between the external vs. internal threads. Either type will create a seal that is more then adequate to preserve your samples and prevent ice crystal formation inside the tube. That being said the best way to prevent ɿreezer burn' inside your sample tubes is to let the whole vial reach room temp before opening the sample and exposing it to ambient air and the moisture in it (cold sample = condensation inside your vial.) So it has a lot more to do with sample handling then the caps ability to seal. Also as far as caps go the best seal is from push-caps or threaded caps with an O-ring. My favorite are the Micronic push-caps

    Honestly, we don't bother storing soil samples in Cryovials at all, regular 2ml screw tops work fine in the -80. Its also useful for late during RNA/DNA extraction in that those tubes with for bead beating.

    A month or two down the line? Negligible effects.

    As someone else said, you can probably get away with using regular screw top vials without much issues and you'll probably save a lot of money. I do this whenever I have a ton of cell culture samples to freeze down and when I am just using -80. As far as I know, the main difference with official cryovials is they are a bit more sturdy so when using them in liquid nitrogen, the rapid pressure change when thawing the vial will prevent cracks/explosions. In practice I'm not sure this is so much of an issue if you store your vials in the vapor phase of liquid nitrogen, but I still use nice vials even then just to be safe. I've used probably 300 standard screw-top vials in the -80 though without any signs of issue or failure. We even use standard eppendorf tubes in our -80 for some certain aliquots and have never had an issue with the vials crack or exploding.


    Dialysis Tubing

    Perform desalting and buffer exchange for 10 to 100mL samples with this 3500-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Carl Roth&trade Regenerated Cellulose Dialysis Tubes Membrane

    Thermo Scientific&trade SnakeSkin&trade Dialysis Tubing, 10K MWCO, 35 mm

    Perform desalting and buffer exchange for 10 to 100mL samples with this 10,000-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Spectrum&trade Spectra/Por&trade 6 Pre-wetted Standard RC Dialysis Tubing, 1-50 kD MWCO

    Clear, flexible and sturdy Standard Grade RC (regenerated cellulose) membrane conveniently pre-equilibrated in water, eliminating the need to soak to remove glycerin and hydrate the membrane

    Spectrum&trade Labs 0.5 - 1.0 kD Biotech CE Dialysis Kits

    With tubing made from biologically inert and ultra-pure Biotech cellulose ester membrane

    Spectrum&trade Labs Spectra/Por&trade 2 and 4 12-14 kD MWCO Standard RC Dry Dialysis Kits

    For smaller dialysis experiments or evaluating dialysis tubing for dialysis application

    Thermo Scientific&trade SnakeSkin&trade Dialysis Tubing, 10K MWCO, 22 mm

    Perform desalting and buffer exchange for 10 to 100mL samples with this 10,000-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Thermo Scientific&trade SnakeSkin&trade Dialysis Tubing, 10K MWCO, 16 mm

    Perform desalting and buffer exchange for 10 to 100mL samples with this 10,000-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Thermo Scientific&trade SnakeSkin&trade Dialysis Tubing, 3.5K MWCO, 35 mm

    Perform desalting and buffer exchange for 10 to 100mL samples with this 3500-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Thermo Scientific&trade SnakeSkin&trade Dialysis Tubing, 3.5K MWCO, 16 mm

    Perform desalting and buffer exchange for 10 to 100mL samples with this 3500-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Thermo Scientific&trade SnakeSkin&trade Dialysis Tubing, 7K MWCO, 22 mm

    Perform desalting and buffer exchange for 15 to 100mL samples with this 7000-MW cut-off (MWCO), ready-to-use form of traditional dialysis membrane tubing.

    Spectrum&trade Labs 3.5 - 5 kD Biotech CE Dialysis Kits

    With tubing made from biologically inert and ultra-pure Biotech cellulose ester membrane

    Spectrum&trade Labs 0.1 - 0.5 kD Biotech CE Dialysis Kits

    With tubing made from biologically inert and ultra-pure Biotech cellulose ester membrane

    Spectrum&trade Spectra/Por&trade 7 Membrane Tubing (Sulfur and Heavy Metal Free): 1 1000 to 50,000 Dalton MWCO

    Ideal for molecular separation, protein binding studies, electrolyte removal, desalting

    Spectrum&trade Labs Spectra/Por&trade 7 Pre-treated Dialysis Tubing

    Convenient dispenser boxes protect unused membranes

    Spectrum&trade Spectra/Por&trade 2 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO

    Ideal for molecular separation, protein binding studies, electrolyte removal, desalting

    Biodesign&trade Cellulose Dialysis Tubing Roll

    Suitable for all types of laboratory dialysis including desalting, compound separation and binding studies.

    Spectrum&trade Labs Spectra/Por&trade 6 25 kD MWCO Standard RC Pre-wetted Dialysis Kits

    With Pre-wetted ready-to-use tubing, not requiring soaking to remove glycerol

    Spectrum&trade Labs 8 - 10 kD Biotech CE Dialysis Kits

    With tubing made from biologically inert and ultra-pure Biotech cellulose ester membrane

    Spectrum Labs&trade Spectra/Por&trade Cellulose Regenerated Tubing Membrane

    For molecular separation, protein binding studies, electrolyte removal and desalting

    Spectrum&trade Trial Size Kits for Biotech-Grade RC Dialysis Membrane Tubing

    0.5 meter (1.6 ft) dialysis tubing length ideal for small applications or membrane evaluation

    Spectrum&trade Labs Spectra/Por&trade 6 10 kD MWCO Standard RC Pre-wetted Dialysis Kits

    With Pre-wetted ready-to-use tubing, not requiring soaking to remove glycerol

    Spectrum&trade Labs Spectra/Por&trade 1 6-8 kD MWCO Standard RC Dry Dialysis Kits

    With Standard Grade Regenerated Cellulose membrane tubing for applications with significant size difference between MW species being separated

    Spectrum&trade Labs Spectra/Por&trade 5 12-14 kD MWCO Standard RC Dry Dialysis Kits

    With Standard Grade Regenerated Cellulose membrane tubing for applications with significant size difference between MW species being separated


    Diskussion

    This study was conducted to optimize conditions for the preparation of frozen mycoplasma reference materials suitable for evaluating alternative NAT-based mycoplasma detection methods and their comparison with conventional culture-based methods currently recommended for mycoplasma testing by regulatory agencies. Comparison of such methods, which rely on measuring naturally different biological features (i.e. GC mot CFU) requires specially prepared and well-characterized reference materials. As NAT-based methods detect mycoplasmal DNA in a sample, regardless of cell viability, the results of any comparison depend, to a great extent, on the GC/CFU ratio in the reference material used. The GC/CFU ratio is an important biological parameter that reflects the viability and aggregation of cells in a culture, both of which should be accurately assessed before selecting a reference stock to compare methods, especially, when the stock has been frozen (Dabrazhynetskaya et al. 2011 Volokhov et al. 2011 ). As many bacteria, including mycoplasmas, have a tendency to aggregate (Maniloff and Morowitz 1972 Rottem 2003 Spiglazov et al. 2004 Voloshin and Kaprel'iants 2005 ), the monitoring of cell aggregation and application of appropriate approaches to reduce aggregation are important for the proper preparation of reference materials suitable to compare methods.

    In this study, we found that aggregation of mycoplasma cells varied significantly from strain to strain, even within a single mycoplasma species. Thus, A. laidlawii strain PG8 formed large and stable cell clumps during growth in a conventional mycoplasma broth, whereas cultures of A. laidlawii strain Laidlaw A were significantly less aggregated and more dispersed when grown under the same conditions (Fig. 1). As result, the GC/CFU ratios of PG8 and Laidlaw A cultures grown for 24 h differed significantly (58 and 12, respectively Tables 2 and 3). Both visual examination of the morphology of colonies formed on surfaces of agar plates and fluorescence microscopy of stained living cells confirmed the presence of large cell aggregates in PG8 cultures, while Laidlaw A cultures showed much less cell aggregation (Fig. 1). The cell aggregates formed in PG8 cultures were stable after vigorous vortexing however, the same aggregates could be efficiently disrupted by sonication without any loss of cell viability (Table 3). As result, the GC/CFU ratio in a PG8 culture dropped from 58 to 1 after sonication, indicating that the cells became monodispersed. Therefore, sonicated cultures of those strains having an innate propensity to aggregate may yield highly viable and monodispersed cell cultures well suited to serve as reference materials for comparison of mycoplasma detection methods.

    The lack of cell walls and the specific lipid composition of the cell membranes make mycoplasma cells very susceptible to damage by freezing (McElhaney et al. 1973 Rottem et al. 1973 Raccach et al. 1975 Mazur 1984 McElhaney 1984 ). The use of optimal cooling rates and CPAs helps to establish a proper osmotic balance inside mycoplasma cells and to minimize the detrimental effects of freezing (Mazur et al. 1984 Hubalek 2003 ). We evaluated the survival of cells in cultures of A. laidlawii, Myc. gallisepticum och Myc. arginini frozen under different cooling rates in the presence or absence of different CPAs. In general, all tested mycoplasmas demonstrated the dependence of cell viability on the cooling rate. Thus, depending on mycoplasma species, an increase in the cooling rate from slow (1°C min −1 ) to rapid snapshot (60°C min −1 ) resulted in a 5-fold increase in cell survival (Fig. 2). I kontrast till A. laidlawii, både Myc. gallisepticum och Myc. arginini stocks were more susceptible to the damage caused by freezing (Fig. 2). This observation can be explained by a specific lipid composition of the A. laidlawii cell membrane (Raccach et al. 1975 Lazarev et al. 2011 ) that increases the permeability of the cells and results in better survival (McElhaney et al. 1973 Mazur et al. 1984 ).

    We observed 10% DMSO and 15% glycerol as CPAs that improved the survival of all mycoplasmas tested (Fig. 2a–c). Although the choice of an optimal CPA to preserve mycoplasma cell cultures seems to depend on innate features of individual species (or even strains), both 10% DMSO and 15% glycerol are satisfactory alternatives for efficient cryopreservation. Surprisingly, 30% glycerol had a toxic effect on mycoplasma cells and, thus, cannot be recommended for cryopreservation of mycoplasma cultures. The periodic monitoring of cell viability for 1 year after freezing confirmed the high stability of all mycoplasma stocks protected with either 10% DMSO or 15% glycerol (Fig. 3a–c). Therefore, addition of CPA at an optimum concentration as well as the use of optimal cooling rates may significantly improve the survival of mycoplasma cells during the preparation and cryopreservation of reference stocks suitable to compare NAT-and culture-based methods.

    It is noteworthy that the use of proper warming rates to thaw frozen mycoplasma stocks may also increase cell recovery. Previously, it was demonstrated that thawing frozen mycoplasma cell cultures in air at ambient temperature gave an optimal warming rate that ensured efficient cell recovery (Raccach et al. 1975 Biddle et al. 2004 Boonyayatra et al. 2010 ). Some frozen mycoplasmas require special conditions for efficient recovery. Our results showed that the efficient recovery of frozen Myc. arginini G230 stocks required using anaerobic conditions for incubating agar plates that allowed us to achieve c. 99·5% efficient recovery of cells. Surprisingly, the use of aerobic conditions for agar plate incubation resulted in a four-log titre loss of Myc. arginini G230 (Fig. 4). The molecular mechanisms of this interesting phenomenon remain unknown. However, as do many other pathogens, Myc. arginini G230 utilizes l -arginine via the arginine deiminase pathway supported by anaerobic metabolism (Broman et al. 1978 Zuniga et al. 2002 Surken et al. 2008 ). The negative effect of aerobic incubation conditions we observed could be caused by inhibition of ornithine carbamoyltransferase, key enzyme of the arginine deiminase pathway, by molecular oxygen (Broman et al. 1978 ). However, we also cannot exclude the possibility of catabolic repression, as arginine-requiring Myc. arginini G230 can utilize glucose in an alternative nonfermentative way (Maniloff 1992 Pollack et al. 1997 ).


    Titta på videon: Ma 4 produktregeln (Februari 2023).