Information

Koncentration av degenererade primers ska du späda till?

Koncentration av degenererade primers ska du späda till?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jag är lite generad att fråga men när du till exempel har fyra degenererade primers och slutprotokollet säger att den slutliga primerkoncentrationen ska vara 10 µM arbetsmaterial, ska du göra primrarna 10 µM totalt (2,5 µM vardera) eller 10 µM för varje degenererad primer?


Du kan bara lägga till 2 µl från varje arbetsmaterial (10 µM) till din PCR -blandning på 20 µl.

Du kan kontrollera detta protokoll.
Varning: Författaren har använt $l$ istället för $mu l$

Han använder 5 µl av varje primer (20 µM) i en 50 µl reaktion. Detta är dubbelt så mycket som jag nämnde. IMO är det bäst att försöka med en lägre koncentration och sedan öka den om det behövs. Överskott av primerkoncentration kan ge upphov till viss ospecifik bindning och amplifiering om primrarna inte är perfekt utformade.

Från denna sida:

Använda degenererade primers

Eftersom en degenererad primer verkligen är en blandning av olika primers, fungerar bara en bråkdel av den degenererade "primern" faktiskt i PCR. Man skulle därför behöva öka primerkoncentrationen i PCR, sekvenseringsreaktioner etc. Om en primer är 8-faldig degenererad bör koncentrationen höjas 4-8-faldigt osv. För högre degenerationer, t.ex. 64-faldig, kan man dock inte öka primerkoncentrationen 64-faldigt och måste bara pröva lyckan med en 5-10-faldig ökning.


Koncentration av degenererade primers ska du späda till? - Biologi

Kurser och naturvetenskapliga bilder

Jack Heslop-Harrison
1920-1998

1. För närvarande beställs primers från SIGMA GENOSYS eller andra beroende på pris (kom ihåg att överväga leveransavgifter och skillnadskostnader vid uppsägningar).

2. Använd webbplatsens beställningssystem som innehåller korrekt information om tillgängliga vågar - om du beställer mer än c. 6 primers, bulk inlämningen är enklare.

3. Beställ liten skala: 0,05 um eller (mindre) 3 OD (men notera från Sigma-Genosys att minimivågen är samma pris som nästa storlek upp så beställ ju större ibland är minimiskalan inte tillgänglig för oligo som innehåller redundans eller ändringar).

4. När oligon kommer, lägg originalbladet och gelbilden i Oligo Master Book. Gör en fotokopia själv.

5. I den laminära flödeshatten, rekonstituera de torkade oligosna i (t.ex. SIGMA) vatten av molekylärbiologisk kvalitet för att göra en 100 µM (mikromolär) stamlösning utöver det ursprungliga förrådsröret och gör två 20 µl (mikro-liter) ) lageralikvoter. (Oligos kommer att vara mer stabila i lätt buffrade salter, t.ex. TE, men detta kan hämma enzymreaktioner.) Databladet kommer att ge antalet ul vatten som behövs för att göra denna utspädning - vanligtvis 300 till 800 & mikrol. (De ger också nanomolerna i syntesen - t.ex. 46,6 nmol. För att göra 100 uM stamlösningen, multiplicera detta med 10 och tillsätt mer än många ul vatten (t.ex. 233 &mikrol för 46,6 nmol = 200 &mikroM stamlösning).

6. Skriv namnet på oligon på locket på stamröret. Lägg sedan originalstocken i en vanlig oligolåda (normalt stora lysrörslådor i höga frysar i Trudes eller Pats låda).

7. Små portioner av specifika oligo -lager kan förvaras i enskilda lådor i ditt frysfack.

8. Gör en liten mängd arbetslösning genom att späda ut alikvoterat 100 & mikroM lager (i laminärt flödeshuv) med vatten av molekylär biologi.

- 1:10 ger en 10 M lösning för genomisk PCR Om du använder 1 & mikrol av detta lager i en 20 & mikrol PCR -blandning använder du 0,4 & mikroM primer i den slutliga blandningen.

- 1:20 ger en 5M för plasmid PCR

9. PCR-installation med YorkBio eller Promega Taq-polymeras (tidigare använde vi Bioline, nu dyrare):

& middot 1,5 1 av 50mM MgCl (slutlig konc. 1,5 mM)

· 5 l PCR-buffert (levereras med Taq)

& middot 1 l 10 mM dNTPmix eller 4 1 av 2,5 mM dNTPmix (slutkonc. 200 M se nedan)

· 0,1-0,5 l Taq-polymeras (=1 enhet till 5 enheter)

· Nedskalning av PCR-inställningen till 20-30 l för markörtypning och testning (även så lågt som 7 l är möjligt). Använd bara 50 & mikrol där du behöver klippa ut och klona

& middot dNTP-blandning: vi brukade göra en 2,5 mM arbetslösning i Tris-HCI men ROCHE rekommenderar att man gör en 10 mM lösning genom att lägga till 5,1 dATP, dCTP, TTP och dGTC (var 100 mM som levereras av ROCHE) till 30 l sterilt dubbeldestillerat vatten.

TÄNK PÅ ATT UTSPÄDDA OLIGOS KAN BRYTA NED NÄR DEN TITAS FLERA GÅNGER.

BÄR ALLTID HANDSKAR VID HANTERING AV OLIGOS.

M13 primer FÖRVARING OCH SPädda ALIKVOTTER KOMMER ATT HÅLLAS I DEN ALLMÄNNA PCR -BOXEN.


Hur man gör en primerutspädning - (2014-06-06)

Så om jag lägger till 667 ul vatten  till den främre och 714ul till den omvända primern , får jag en 100uM lager?

Jag behöver en slutkoncentration på 100 pmol av varje primer i en 25ul reaktion så hur mycket behöver jag för att späda ut min 100uM lager?

All hjälp skulle uppskattas!

så du har 100 x 10^-6 mol/liter och du måste ha 100 x 10^-12 mol/liter (som koncentration) i 25 µl.

du måste späda 10^6 gånger alltså, men ta med 25µl.

100 x 10^-12 mol för 1 liter, betyder för 25µl => ?

du borde kunna beräkna detta själv.

Men är du säker på att du behöver 100pM? Känns lite lågt för mig.

Ja, jag behöver 100 pmol slutkoncentration av primer

Så jag behöver späda ut 100uM 1 på 1 000 000?

Slutlig koncentration av primers 100 pM för en PCR? Är det någon sorts konstig PCR som använder 1000 gånger lägre slutkoncentration i reaktionen än det vanliga området? (0,1 - 0,5 µM)

Eller är det så pmol/µl eller bara något annat molar koncentration än per liter (så 100 µM primers är lika med 100pmol/µl primers).

I vilket fall som helst vill du inte späda ut dina primers till slutkoncentrationen, men till en arbetskoncentration 10-20-50x eller så högre än målet måste du också lägga till andra saker i reaktion. Volymen på de primrar som används måste vara lämpligt låg men inte för låg för att pipetteras exakt.

Till exempel:

Lagerlösning för varje primer är vanligtvis 100 µM (100pmol/µl).  

Du gör en fungerande lösning på 10 µM av det (späd 10x).

För en 20 µl PCR -reaktion använder du 1 µl arbetslösning av varje primer (och har så utrymme för att tillsätta andra reagenser) för att uppnå slutkoncentration i reaktion 0,5 µM av varje.  

Tack för ditt svar och räkneexempel.

Jag tog   volymen från  a papper jag läste och det stod att lägga till 100pmol av varje primer till en 25ul reaktion, så jag antog att det betydde att#160 det var den slutliga koncentrationen   av primern, eller att jag inte tolkade det korrekt ?

om det står att lägga till 100pmol till 25µl så har du 100pmol/25µl eller 4pmol/µl eller 4 x 10^-12mol/10^-6liter eller 4 x 10^-6mol/liter eller 4µM

Så måste jag späda ut några av mina 100uM lager för att få 4uM och lägga till hur mycket av detta som jag lägger till i reaktionen?

Du behöver 100pmol i din reaktion, fixa det (trodde det är ganska mycket, tvärtom, men ändå ..).

Du har 100uM lager. Du kan också uttrycka denna koncentration som 100 pmol/ul (det är lika med 100 uM).

Det betyder att i en 1ul lager har du 100pmol primer.

Så, har du en aning om hur mycket du kommer att använda i din reaktion?

Behöver jag 2500 pmol, så om jag tillsätter 1 l av det till en 25 µl reaktion kommer det att spädas till 100 pmol?

caroloconnor20 den mån 7 april 07:08:27 2014 sa:

Jag behöver 2500 pmol så om jag lägger till 1 ul av det till en 25 ul reaktion kommer det att spädas ut till 100 pmol?

Nej. du behöver 100 pmol i den totala reaktionen. det betyder att du måste tillsätta 1 ul av 100 um lager.


Metoder och teknik för genetisk analys

Polymeras kedjereaktion, eller PCR, är en grundläggande metod som används i molekylärbiologi för att producera kopior av en liten målregion av DNA i ett prov. Grunderna för PCR diskuterades tidigare här. Kopiorna av DNA som produceras av PCR ger forskare tillräckliga kopior för andra tillämpningar inom forskning inklusive automatiserad Sanger -sekvensering. Även om det finns grundläggande metodik för de flesta PCR-metoder, är varje reaktion olika och kräver optimering, en process för att justera variabler och producera en enda önskad produkt. Det finns flera faktorer att tänka på när man optimerar PCR, såsom totala kopior av mål -DNA, primerkoncentration, MgCl2 och deoxynukleotider eller dNTP. Vissa av dessa variabler beror på den totala volymen av PCR-reaktionen eftersom den slutliga koncentrationen av komponenterna i PCR bör vara konstant beroende på om reaktionen är 25 ul, 50 ul eller 100 ul. I denna artikel kommer vi att fokusera på två variabler, antalet kopior av mål -DNA och primerkoncentration.

Mallen: Mål -DNA

Att generera kopior av en mål-DNA-region med PCR-applikationer är inte lika känsligt för kvaliteten på mall-DNA:t jämfört med Sanger-sekvensering. Det är dock fortfarande lämpligt att använda ett relativt rent DNA -prov fritt från salter och andra föroreningar. Ren mall -DNA har en större sannolikhet att generera en ren PCR -produkt. Det slutliga utspädda provet av mål -DNA späds bättre i vatten snarare än buffert eftersom buffertar kan störa svåra PCR -amplifieringar.

Den viktigaste aspekten av mål -DNA att överväga är det totala antalet kopior i reaktionen som är tillgänglig för amplifiering. Mål -DNA tillhandahåller den initiala mallen för amplifieringen av den första uppsättningen produkter som amplifieras och fortsätter att tillhandahålla mallen för de återstående cyklerna. När PCR-produkter genereras tillhandahåller de också kopior av mål-DNA som används som mall för amplifiering. Det är detta som gör att PCR kan generera miljontals kopior av en målregion. Därför är det viktigt att tillräckliga kopior av det ursprungliga mål -DNA: t finns i reaktionen. För många kopior av det ursprungliga målet kan leda till generering av falska produkter tidigt i PCR som också fungerar som mall -DNA. Mall-DNA som isolerats från bakterier kan endast bestå av ett genom på 2 miljoner baser, medan det mänskliga genomet har 3 miljarder baser. Därför kommer bakteriellt genomiskt DNA att ha mycket fler kopior av målet i ett 50 ng -prov än humant DNA. För bakteriellt DNA kräver 10E5 -kopior endast 300 pikogram DNA. För mänskligt DNA kommer 10E5 att kräva över 300 nanogram DNA, en miljonfaldig skillnad.

PCR-förhållanden rekommenderar i allmänhet 10E4 till 10E5 kopior av mål-DNA:t i reaktionen oberoende av den totala volymen. Det finns viss flexibilitet i kopieringsnumret för målsekvensen. Emellertid kommer fler kopior av mål -DNA att minska specificiteten för PCR -reaktionen och sannolikt producera ett större antal falska produkter. Det totala antalet cykler för PCR bör reduceras när högre koncentrationer av mål -DNA är i reaktionen.

Koncentration av primrarna

Primers är den avgörande faktorn för vilken region av DNA som kommer att amplifieras med PCR. Framåt- och bakåtprimern måste ha en exakt basmatchning med början och slutet av målområdet. Överdriven primerkoncentration är kanske en viktig faktor som ofta orsakar generering av falska produkter i en PCR. För mycket primer minskar specificiteten och detta kommer att tillåta primers att hybridisera i områden av mallen som inte är målregionen. Resultaten av överdriven primers ses ofta i orena Sanger -sekvenseringsresultat eftersom falska produkter kan sekvenseras tillsammans med det önskade målet. Mängden framåt och bakåt primer bör begränsas för att minska eventuell falsk priming. Överdriven koncentration av framåt- och bakåtprimrar kan också orsaka bildning av primer -dimer när primrarna glödgar och förstärker sig oberoende av mål -DNA: t.

Primerkoncentration är en variabel beroende på den totala volymen av PCR -reaktionen för att tillräckliga kopior av primern ska hitta målglödgningsställena. En total koncentration av 0,5 mikro-molar (uM) till 1 uM är i allmänhet tillräcklig för att förstärka de flesta målregioner, även om en mindre koncentration också kan fungera i vissa applikationer. Vanligtvis använder vårt laboratorium en slutlig koncentration på 0,8 uM för de flesta PCR -reaktioner. Den slutliga bedömningen av primerkoncentrationen kommer att ses efter att produkterna har underkastats elektrofores på en agarosgel för att visa antalet amplifierade produkter.

Vi använder en relativt enkel beräkning för att späda primers till en slutlig koncentration av 10 uM som visas med start med den primära primerkoncentrationen på 1 mikrogram (ug)/mikroliter (ul). Det kräver att primerns molekylvikt (MW) är känd och bör tillhandahållas tillsammans med primern.

1 ug/ul *1umol/MW (ug) *10E6 ul/l = koncentration umol/l som är lika med uM

En primer med slutkoncentrationen 200 uM kommer att spädas genom tillsats av 1 ul av primern till 19 ul vatten för en slutkoncentration av 10 uM. Detta är vår arbetskoncentration för PCR. För en slutkoncentration av 0,8 uM tillsätts 2 ul av framåt- och bakåtprimern till en 25 ul -reaktion medan 8 ul av varje skulle sättas till en 100 ul -PCR -reaktion.

Primerkoncentration är en av de viktigare variablerna att tänka på när man optimerar en PCR -reaktion. Koncentrationer större än 1 uM kan ofta leda till att primers glöms längs icke-målområden och genererar falska produkter. Otillräckliga koncentrationer av endera primern kan resultera i liten eller ingen amplifiering.


Tips för att återsuspendera och späda dina oligonukleotider

Du har fått dina anpassade oligonukleotider, och nu är det dags att återsuspendera och späda ut dem. Här är några tips från våra forskare som hjälper till att underlätta användningen av oligon i dina experiment.

Oligo återsuspension

Om du får dina oligos torra måste du återsuspendera dem i vattenlösning före användning. De flesta oligon är relativt lätta att återsuspendera, men de som modifierats med fluoroforer eller hydrofoba molekyler kan kräva mer tid för att bli fullständigt solubiliserade.

Nedan följer några användbara rekommendationer från våra forskare. För vägledning om oligonukleotidlagring, se artikeln, Lagring av oligos: 7 saker du bör veta.

  • Under uttorkningsprocessen bildar oligos en vit fläckig pellet vid botten av röret. Eftersom pelleten kan lossna under transporten är det avgörande att varje oligo kort centrifugeras innan röret öppnas. Underlåtenhet att göra det kan resultera i avkastningsförlust, eftersom oligopellets som inte finns i rörets botten kan flyga ut ur röret när locket öppnas.
  • Om resuspension är svårt, prova att värma oligon vid 55&°C i 1&ndash5 minuter och vortexa sedan ordentligt. Om några fällningar kvarstår är de troligen antingen tritylgrupper (fläckigt utseende) eller det kontrollerade poriga glaset (CPG en pellet i botten av röret) på vilket oligon syntetiserades. Ingen av dem ska påverka oligoprestanda, och båda kan tas bort och bara kunna köra den återsuspenderade oligon genom en Sephadex & reg G-50-kolumn (GE Healthcare) eller överföra supernatanten (som innehåller oligon) till ett nytt rör.
  • IDT -oligonukleotider (både DNA och RNA) skickas vanligtvis torrt. Du kan dock begära att få dina DNA-oligos återsuspenderade före leverans. För att få återsuspenderade oligon, använd Normalisering rullgardinsmenyn (se figur 1) på Oligo Entry -beställningsverktyget. Här kan du välja LabReady (100 & mikroM i IDTE, pH 8,0), eller skapa en anpassad formulering enligt dina specifikationer.
  • Utsätt inte dina oligos för mycket sura eller basiska förhållanden när som helst under resuspension. Vi rekommenderar att oligo återsuspenderas i en TE-buffertlösning, såsom IDTE, för att bibehålla ett konstant pH som stöder oligostabilitet (IDTE finns tillgängligt från IDT vid pH 7,5 och pH 8,0). Alternativt resuspendera oligos i nukleasfritt, sterilt vatten, pH 7,0 (HPLC-kvalitet är att föredra att få från IDT).

Obs: För långtidsförvaring, undvik att återsuspendera oligos i DEPC-behandlat vatten eller vatten från avjoniseringssystem. Dessa är ofta sura (pH så lågt som 5) och kan orsaka DNA-nedbrytning med tiden.


Så här gör du en lagringslösning på 100 &mikroM:

  1. Hitta information om oligoutbyte (i nmol) på röretiketten eller specifikationsbladet.
  2. Multiplicera detta tal med 10.
  3. Den resulterande produkten är mängden buffert som behövs i & microL för att förbereda en 100 & microM lösning. (Om utbytet är 9 nmol behövs 90 & mikroL buffert för att göra en 100 & mikroM lösning.)

Obs: Vid 100 & mikroM koncentration innehåller 1 & mikroL lösning 100 pmol oligo. PCR kräver vanligtvis 10&ndash50 pmol av varje primer per reaktion.

För att göra lagringslösningar i andra koncentrationer:

  1. Hitta information om oligoutbytet på tubetiketten eller specifikationsbladet. Detta kommer att listas i 3 former & mdashoptisk densitet (OD), nanomol (nmol) och massa (mg).
  2. Ange en av dessa avkastningsmätningar i Kvantitet rutan i Resuspension Calculator och välj lämpliga enheter.
  3. I Slutlig koncentration ange önskad lagerkoncentration och välj igen lämpliga enheter.
  4. Klick Beräkna. Verktyget kommer att bestämma volymen buffert/vatten som behövs för att skapa önskat lager.

Alternativa lagrings- och arbetslösningskoncentrationer kan enkelt göras med vår Resuspension Calculator.

Obs: Baserat på de valda enheterna kan du behöva ange molär extinktionskoefficient och/eller molekylvikten för din oligo. Denna information finns på ditt oligospecifikationsblad.

Så här gör du ett arbetslager från lagermaterial:

Arbetslager kan enkelt göras från lagerlager med hjälp av vår utspädningsberäknare.

  1. Ange startkoncentration och volym och välj sedan lämpliga enheter.
  2. Ange den slutliga (önskade) koncentrationen och volymen och välj lämpliga enheter.
  3. Klick Beräkna. Verktyget bestämmer mängden buffert/vatten som behövs för att späda ut ditt lagermaterial till önskad koncentration av arbetsmaterial.

Obs! Baserat på de valda enheterna kan du behöva ange din oligos molekylvikt. Denna information finns på ditt oligospecifikationsblad.


Standard PCR -protokoll

Buffert: Använd egenutvecklad eller hemgjord 10x rxn-blandning, t.ex.: Cetus, Promega. Detta bör innehålla: minst 1,5 mM Mg2+, vanligtvis något rengöringsmedel, kanske lite gelatin eller BSA. Promega levererar nu 25mM MgCl2, för att tillåta användarspecificerad [Mg2+] för reaktionsoptimering med olika kombinationer av primers och mål.

GÖR POOLAD MASTERBlandning av reagenser i frånvaro av DNA med hjälp av DNA-fri pipett, dosera sedan till enskilda rör (med hjälp av DNA-fri pipett) och tillsätt DNA till enskilda reaktioner ANVÄNDA KOPPLADE TIPS.

OVERLAY REAKTIONER MED 50UL AV HÖGKVALITET FLYTANDE PARAFIN ELLER MINERALOLJA för att säkerställa att ingen avdunstning sker: detta ändrar reaktantkoncentrationerna. NOTERA: senaste visdom har det man kan använda VASELIN - detta tillåter också & quotHOT START & quot PCR.

ANVÄND PIPETTSTIPS: förhindrar aerosolkontaminering av pipetter.

Användning av tvättmedel rekommenderas endast för Taq från Promega (upp till 0,1% v/v, Triton X-100 eller Tween-20). DMSO tillåter tydligen bättre denaturering av längre målsekvenser (& gt1kb) och mer produkt.

ANVÄND INTE SAMMA PIPETTE FÖR UTDELNING AV KÄRNSYROR SOM DU ANVÄNDER FÖR UTSKILLNING AV REAGENSER

Kom ihåg att provvolymen inte får överstiga 1/10:e reaktionsvolymen och att provets DNA/NTP/primerkoncentrationer inte bör vara för höga eftersom annars allt tillgängligt Mg2+ keleras ur lösningen och enzymreaktiviteten påverkas negativt. Varje ökning av dNTP över 200uM betyder att [Mg2+] bör optimeras på nytt.

UNDVIKA ATT ANVÄNDA EDTA-INNEHÅLLANDE BUFFER SOM EDTA CHELATER Mg 2 +

Låga primer-, mål-, Taq- och nukleotidkoncentrationer är att gynna eftersom dessa i allmänhet säkerställer renare produkt och lägre bakgrund, kanske på bekostnad av detekteringskänslighet.

Rekommenderade reaktionsförhållanden:

Initiala villkor:

Initial denaturering vid start: 92 - 97oC i 3 - 5 min. Om du denaturerar vid 97oC lägger denatureringsprovet bara till resten av blandningen efter att reaktionen har samlats till glödgningstemperatur (förhindrar för tidig denaturering av enzym).

Initial glödgningstemperatur: så hög som möjligt i 3 minuter (t.ex.: 50 - 75oC). Stringenta initiala villkor betyder mindre ospecifik produkt, speciellt vid amplifiering från eukaryot genomiskt DNA.

Initial töjningstemperatur: 72oC i 3 - 5 min. Detta möjliggör fullständig förlängning av produkten på sällsynta mallar.

Temperaturcykling:

  • 92 - 94 o C i 30 - 60 sekunder (denaturering)
  • 37 - 72 o C i 30 - 60 sekunder (glödgning)
  • 72 o C i 30-60 sek (långsträckt) (60 sek per kb målsekvenslängd)
  • Endast 25 - 35 cykler (annars orsakar enzymförfall artifakter)
  • 72 o C i 5 minuter i slutet för att tillåta fullständig förlängning av allt produkt-DNA

& quotQuickie & quot PCR är ganska genomförbart: t.ex. [94 o C 30 sek / 45 o C 30 sek / 72 o C 30 sek] x 30, för korta produkter (200 - 500 bp).

DU KAN ANVÄNDA GLYCEROL I TERMISKA CYKLERREAKTIONSRÖRHÅLLNINGAR FÖR ATT SÄKRA GODA TERMISKA KONTAKTER

KÖR INTE FÖR MÅNGA CYKLAR: om du inte ser ett band med 30 cykler har du förmodligen inte vunnit efter 40 snarare ta en alikvot från reaktionsblandningen och åter-PCR med färska reagenser. Ser här.

& quotHot Start & quot PCR:

Under vissa omständigheter vill man det undvik att blanda primrar och mål -DNA vid låga temperaturer i närvaro av Taq polymeras: Taq pol är nästan lika effektivt som Klenow pol vid 37 o C följaktligen, om primers felglödgas vid låg temperatur före den första malldenatureringen, "icke-specifik" förstärkning kan förekomma. Detta kan undvikas genom att endast tillsätta enzym efter den initiala denatureringen, innan reaktionen svalnar till den valda hybridiseringstemperaturen. Detta görs enklast genom att lägga vax "gems" TM in i reaktionsröret efter tillsats av allt utom enzym, sedan läggs enzymet ovanpå pärlan: vaxet smälter när temperaturen når +/- 80 o C, och enzymet blandas med resten av reaktionsblandningen medan det smälta vaxet flyter ovanpå och förseglar blandningen, tar plats för mineralolja. Information är att & quotgems & quot kan ersättas av Vaseline TM.

Asymmetrisk PCR för ssDNA -produktion:

Använd helt enkelt ett 100: 1 molförhållande av de två primrarna (t.ex. primer 1 vid 0,5 uM, primer 2 vid 0,005 uM). Detta möjliggör produktion av huvudsakligen ssDNA av betydelsen av den mer rikliga primern, vilket är användbart för sekvensering eller för att göra ssDNA -sonder.

Upptäcka produkter:

Ta 1/10 - 1/3 av reaktionsblandningen NOGGRANT från under oljan eller från under vaselin eller stelnat vax, med hjälp av en mikropipett med tilltäppt spets, I ETT OMRÅDE BORT FRÅN DIN PCR -FÖRBEREDELSESOMRÅDE!

Blanda detta med lite gelbelastningsbuffert (1: 1 - 1: 5 mix: laddningsbuffert): detta är TBE innehållande 10 - 20% glycerol eller sackaros och en skvätt bromfenolblått (BPB) spårningsfärgämne.

Ladda 5 - 30 ul prov i brunnar med 0,8 - 3,0% ubåtsagarosgel som består av TBE, företrädesvis innehållande 50 ng/ml etidiumbromid.

Kör på 80 -120 volt (inte för långsamt eller små produkter diffunderar inte för snabbt eller band smetar ut) tills BPB når slutet av gelen (stora produkter) eller 2/3 ner gelen (små produkter). Använd DNA-markörer som går från 2 kb ner till 100 bp eller mindre (rekommenderar BM PCR-markörer).

Se på UV-ljuslåda vid 254 - 300 nm, foto 1 - 5 sek.

Små produkter syns bäst på 3% agarosgeler det har varit Spring snabbt (t.ex.: 100 volt), med BPB kör till & frac12 - 2/3 ner i gelen. Det är bäst att inkludera EthBr i gelén OCH i gelbufferten , eftersom färgning efter elektrofores kan resultera i bandsmettning på grund av diffusion, och om det inte finns något EthBr i bufferten rinner färgen baklänges ut ur gelén, och mindre band tas av färgen och är inte synliga.

NUSIEVE TM gel (FMC Corp) kan även användas för små produkter - bättre upplösning än agaros.

Polyakrylamid geler kan färgas silver av enkla protokoll för extrem känslighet av detektion.

Geler kan blottas direkt efter blötläggning i 0,5 M NaOH / 1,5 M NaCl i 10-20 minuter: "dry blotting" fungerar bra (t.ex.: gel är över- och underskiktad med pappershandduksstaplar och pressade band överförs upp och ner), liksom klassisk "Southern" blotting . Band som raderas på detta sätt är redan kovalent fixerade på nylonmembran och behöver helt enkelt sköljas i 5xSSPE före förhybridisering.

Exemplet som visas är av detektering av Mänskligt papillomvirus typ 16 (HPV-16) DNA amplifierat från cervikala biopsiprover (Williamson A-L, Rybicki EP (1991) Detektion av genitala humana papillomvirus genom polymeraskedjereaktionsförstärkning med degenererade kapslade primrar. J Med Virol 33: 165-171). Den vänstra panelen är ett foto av en EthBR-färgad 2% agarosgel till höger är en autoradiograf av en Southern blot undersökt med 32 P-märkt HPV-16 DNA. Observera hur mycket mer känslig blotting är och hur mycket mer specifik detekteringen är.

Märkning av PCR -produkter med Digoxigenin

PCR-produkter kan mycket bekvämt märkas med digoxigenin-11-dUTP (Boehringer-Mannheim) genom att inkorporera reagenset till 10-35% slutlig effektiv dTTP-koncentration i en nukleotidblandning av slutkoncentrationen 50-100uM dNTPs (Emanual, 1991 Nucleic Acids Res 19 : 2790). Detta möjliggör substitution i en känd omfattning av sonder med exakt definierad längd, vilket i sin tur tillåter exakt definierade bybridiseringsförhållanden. Det är också det mest effektiva sättet att märka PCR-produkter, eftersom det är potentiellt osäkert och MYCKET dyrt att försöka göra på liknande sätt med 32P-dNTPs, och nick-translation eller slumpmässig grundad etikettinkorporering är olämpliga eftersom mallarna ofta är för små för effektiva märkning.

Gör en DIG-dNTP-mix för PCR enligt följande:

DIG NUKLEOTIDMIX KONCENTRATIONER

  • Dig-11-dUTP 350 uM
  • dTTP 650 uM
  • dATP 1 mM
  • dCTP 1 mM
  • dGTP 1 mM

För varje 50 ul sond som syntetiseras, görs en 1/10 spädning av DIG-nukleotidblandningen när den tillsätts till de andra reagensen enligt beskrivningen ovan. Produkterna kan analyseras med agarosgelelektrofores - OBS: PRODUKTER ÄR STÖRRE ÄN DEN IKKE-BYTDA PRODUKTEN - och detekteras direkt på fläckar immunologiskt. Prober kan användas som 5-10 ul alikvoter direkt från PCR-produktblandningar, blandas med hybridiseringsblandning och denatureras. Prober kan återanvändas upp till 10 gånger, förvaras frysta mellan experimenten och kokas för att denaturera.

Rengöring av PCR -produkter

  • Att bli av med mineralolja: tillsätt helt enkelt 50 ul kloroform till reaktionsflaskan, virvel och centrifugera kort och ta bort den & kvantifierande droppen & quot av VATTENHALTIG lösning med en mikropipett.
  • Bli av med vax eller vaselin: helt enkelt & quotspear & quot vaxpärla och ta bort gör som för olja eller botten-punkteringsrör och blåsa ut vattenhaltig droppe för vaselin.
  • Rengörings-DNA: 3 alternativ
    • ett protokoll som ger DNA som är tillräckligt rent för sekvensering är följande: öka volymen till 100 ul med vatten, tillsätt 10M ammoniumacetatlösning. till 0,2 M slutkoncentration (1/5 volym), tillsätt lika stor mängd isopropanol (propan-2-ol), låt stå på bänken 5 minuter, centrifugera 20 minuter vid 15 000 rpm, ta bort vätska med pipett, återsuspendera i 100 ul vatten eller TE , upprepa nederbörd.
    • Gör helt enkelt en fenol-CHCl3-extraktion (tillsätt 20 ul fenol till vattenfasen, vortexa, tillsätt 50 ul CHCl3, vortexa, centrifugera, ta bort ÖVRE vattenfas, upprepa CHCl3 -extraktion).
    • Gör vattenfas upp till 400 ul och snurra genom Millipore Ultrafree-MC NMWL 30 000 patroner (vid 6000 rpm i mikrocentrifug), skölj igenom med 2x400 ul vatten, samla +/- 20 ul prov: detta är tillräckligt rent för sekvensering.

    Produkten är tillräckligt ren för att begränsa matsmältningen omedelbart efter reaktionen, men fenol-kloroformrensning rekommenderas som ett minimum.

    Sekvensering av PCR-produkter:

    Detta görs bäst med användning av ssDNA genererat av asymmetrisk PCR och den "begränsande" primern för sekvensering. Effektiv sekvensering av dsDNA som genereras av normal PCR är dock möjlig med modifieringen av SequenaseTM-protokollet publicerat av Bachmann et al. (1990) (NAR 18: 1309). RENT DNA återsuspenderas i sekvenseringsbuffert innehållande 0,5 % Nonidet P-40 och 0,5 % Tween-20 och sekvenseringsprimer, denatureras genom uppvärmning till 95oC i 5 minuter, snabbkyles på våt is och sekvenseras enligt "close-to-primer"-protokollet (t.ex. : utspädda förlängningsblandningar).

    Kloning av PCR-produkter

    T-A-kloningsstrategi: Taq och andra polymeraser tycks ha en terminal transferasaktivitet som resulterar i icke-mallad tillsats av en enda nukleotid till 3 '-ändarna av PCR-produkter. I närvaro av alla 4 dNTP, tillsätts dA företrädesvis, men användning av en enda dNTP i en reaktionsblandning resulterar i (relativt ineffektiv) addition av den nukleotiden. Detta komplicerar kloning, som den förmodade trubbiga PCR-produkten ofta inte är, och trubbiga kloningsprotokoll fungerar ofta inte eller är mycket ineffektiva. Detta kan åtgärdas genom inkubering av PCR-produkter med T4 DNA pol eller Klenow pol, som & polerar & quot ändarna på grund av en 3 '- & gt5 ' exonukleasaktivitet (Lui och Schwartz, 1992 BioTechniques, 20: 28-30). Denna terminala transferasaktivitet är dock också grunden för en smart kloningsstrategi: denna använder Taq pol för att lägga till en enda dT till 3 '-ändarna av en trubbig kloningsvektor såsom pUC eller pBluescriptTM, och enkel ligering av PCR-produkt till den nu "klibbiga änden" plasmiden (Marchuk et al., 1990 NAR 19: 1156).

    Införlivande av restriktionsplatser i primers: Även om detta kan göras enkelt genom att införliva samma eller olika restriktionsställen vid 5'-ändarna av PCR-primrar - vilket möjliggör generering av klibbiga ändar och enkel kloning i lämpliga vektorer - bör dessa ha ÅTMINSTONE två ytterligare baser 5 ' till igenkänningssekvensen för att säkerställa att enzymerna faktiskt kommer att känna igen sekvensen - och det visar sig ofta att även när detta är gjort är effektiviteten vid skärning av färsk produkt näst intill noll. Detta kan ibland åtgärdas genom att inkubera färsk produkt med Proteinase K (för att smälta bort tätt fastsatt Taq pol), men är ofta inte det. En lösning på problemet är att använda metoden & quotKlenow-Kinase-Ligase & quot (KKL): detta innebär att & polera & quot produkter med Klenow, kinasera dem för att få 5 '-fosforylering (OBS: OLIGONUKLEOTIDPRIMERAR HAR NORMALT NO 5 '-FOSFATER. 20 sammanbinda fragmenten för att erhålla konkatemerer och sedan begränsa dessa med lämpliga restriktionsenzymer för att generera de klibbiga fragmenten som är lämpliga för kloning (Lorens, 1991 PCR Methods and Applications, 1: 140-141).


    Vi hittade åtminstone 10 Webbplatser Listning nedan vid sökning med utspädande primrar för pcr på sökmotorn

    Protokoll: återupphängande PCR -primrar

    • Primers skickas och mottas ofta i frystorkat tillstånd
    • Skapa först ett master 100 × lager (för varje primer och då utspädd det till ett 10 × fungerande lager
    • Detta minskar antalet frys/tina cykler som befälhavaren primer aktien går igenom

    PCR -primerspädning för aktier och oligonukleotider

    Le.ac.uk DA: 12 PA: 24 MOZ Rank: 37

    • OLIGONUCLEOTIDES och utspädning av primers för PCR 1
    • För närvarande primers beställs från SIGMA GENOSYS eller andra beroende på pris (kom ihåg att överväga leveransavgifter och skillnadskostnader med uppsägningar). 2.

    Lab Math Primer Förberedelse och utspädning

    Aphl.org DA: 12 PA: 50 MOZ Rank: 64

    Primer rapporterad mängd: 155,5 nmol = 0,96 mg = 960 μg Om du vill ha en stamlösning på 1 μg/μL, återsuspendera oligo i 960 μL ddH 2 O eller TE-buffert: 960 μg / 960 μL = 1,00 μL = 1,00 μng μL Om du vill ha en arbetslösning på 100 ng/μL gör en 1:10 utspädning från lager: - Tillsätt 1,0 μL från Stock (1 μg/μL) till 9,0 μL ddH 2 O eller TE-buffert (1:10).

    Primerutspädning och beräkning

    • Vi får primers frystorkat så lägger vi till den erforderliga mängden TE/vatten för att göra en stam sol
    • Så slutvolymen av varje primers lagervolymen varierar
    • Jag använder 10pmol för det PCR så jag skulle utspädd lager 10x

    Tips för återsuspendering och utspädning av oligonukleotider

    Idtdna.com DA: 14 PA: 50 MOZ Rank: 68

    • Obs: Vid 100 µM koncentration innehåller 1 µL lösning 100 pmol oligo
    • PCR kräver vanligtvis 10–50 pmol av varje primer per reaktion
    • För att göra lagringslösningar i andra koncentrationer: Hitta information om oligo -avkastning på röretiketten eller specifikationsbladet
    • Detta kommer att listas i tre former - optisk densitet (OD), nanomol (nmol) och

    Polymeras kedjereaktion: Basic Protocol Plus

    • Att designa lämpligt primers är avgörande för det framgångsrika resultatet av a PCR experimentera
    • När du designar en uppsättning av primers till en specifik region av DNA som önskas för amplifiering, en primer bör glödja till plussträngen, som konventionellt är orienterad i 5 '→ 3' -riktningen (även känd som sense- eller nontemplate -strängen) och den andra primer borde komplettera ...

    Oligo Dilution Calculator LGC Biosearch Technologies

    • Utveckla ett molekylärt diagnostiskt test som påskyndar resultaten
    • Använder sig av PCR att designa din molekylära diagnostiska analys
    • Anpassade och OEM -enzymer och reagenser för nästa generations sekvensering (NGS) MDx -resurser
    • Att välja en leverantör av molekylär diagnostik

    Kan jag direkt sekvensera en PCR -produkt

    • Vänligen uppskatta din PCR produktkoncentrationer på en analytisk gel, och utspädd dem enligt rekommendationer
    • Ineffektiv primers är ibland OK för PCR, men samma primers kan misslyckas i sekvenseringen
    • Eftersom PCR är i sig en exponentiell process, och eftersom den vanligtvis bärs långt bortom slutförandet, till och med ganska dålig primers

    Beräkning av primer- och probkoncentrationer Thermo

    För att inte slösa bort det dyrbara primer, forskaren utspädd it 1: 100 i 1X TE -buffert för att uppnå en slutvolym på 1 ml (10 µL primer lösning och 990 µL av 1X TE—detta är en utspädning faktor 100).


    Saiki, R.K. et al. Enzymatisk amplifiering av beta-globins genomiska sekvenser och restriktionsanalys för diagnos av sicklecellanemi. Vetenskap 230, 1350–1354 (1985).

    Saiki, R.K. et al. Primerriktad enzymatisk amplifiering av DNA med ett termostabilt DNA-polymeras. Vetenskap 239, 487–491 (1988).

    Mullis, K. et al. Specifik enzymatisk amplifiering av DNA in vitro: polymeraskedjereaktionen. Cold Spring Harb. Symp. Antal. Biol. 51 (Del 1): 263–273 (1986).

    Kolmodin, L.A. & amp; Birch, D.E. Polymeraskedjereaktion. Grundläggande principer och rutinövningar. Metoder Mol. Biol. 192, 3–18 (2002).

    Kramer, M.F. & Coen, D.M. Enzymatisk amplifiering av DNA genom PCR: standardförfaranden och optimering. Curr. Protokoll. Mol. Biol. Kapitel 15, enhet 15 1 (2001).

    Don, R.H., Cox, P.T., Wainwright, B.J., Baker, K. & Mattick, J.S. 'Touchdown' PCR för att kringgå falsk priming under genamplifiering. Nukleinsyror Res. 19, 4008 (1991).

    Wu, W.M. et al. Touchdown-termocykelprogram möjliggör en robust enkel nukleotidpolymorfism-typningsmetod baserad på allelspecifik realtidspolymeraskedjereaktion. Anal. Biochem. 339, 290–296 (2005).

    Nolan, T., Hands, R.E. & amp Bustin, S.A. Kvantifiering av mRNA med realtids-RT-PCR. Nat. Protokoll. 1, 1559–1582 (2006).

    Panjkovich, A. & amp; Melo, F. Jämförelse av olika beräkningsmetoder för smälttemperatur för korta DNA -sekvenser. Bioinformatik 21, 711–722 (2005).

    Kibbe, W.A. OligoCalc: en onlinekalkylator för oligonukleotidegenskaper. Nukleinsyror Res. 35, W43–W46 (2007).

    Borer, P.N., Dengler, B., Tinoco Jr. I. & amp Uhlenbeck, O.C. Stabilitet av ribonukleinsyra dubbelsträngade spiraler. J. Mol. Biol. 86, 843–853 (1974).

    Steger, G. Termisk denaturering av dubbelsträngade nukleinsyror: förutsägelse av temperaturer som är kritiska för gradientgelelektrofores och polymeraskedjereaktion. Nukleinsyror Res. 22, 2760–2768 (1994).

    SantaLucia Jr. J. En enhetlig bild av polymer-, hantel- och oligonukleotid-DNA-termodynamik. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1460–1465 (1998).

    Santa Lucia Jr., Allawi, H.T. & Seneviratne, P.A. Förbättrade närmaste parametrar för att förutsäga DNA-duplexstabilitet. Biokemi 35, 3555–3562 (1996).

    Sugimoto, N., Nakano, S., Yoneyama, M. & amp Honda, K. Förbättrade termodynamiska parametrar och helix initieringsfaktor för att förutsäga stabilitet hos DNA -duplex. Nukleinsyror Res. 24, 4501–4505 (1996).

    Hecker, K.H. & Roux, K.H. Höga och låga glödgningstemperaturer ökar både specificitet och utbyte vid touchdown och stepdown PCR. Bioteknik 20, 478–485 (1996).

    Zhang, Z. & amp; Martineau, D. Enrörs heminesterad PCR i kombination med "touchdown" PCR för analys av den malley sarkomvirus env-genen. J. Virol. Metoder 60, 29–37 (1996).

    Rubie, C. et al. Multistep-touchdown vectorette-PCR-en snabb teknik för identifiering av IVS i gener. Bioteknik 27, 414–416, 418 (1999).

    Duckworth, A.W. & amp Rule, S.A. Användningen av "touchdown" -polymeraskedjereaktion ökar känsligheten och specificiteten för t (1114) (q13q32) -detektering hos patienter med mantelcelllymfom. Br. J. Haematol. 121, 952–953 (2003).

    De la Horra, C. et al. Jämförelse av enkla och touchdown-PCR-protokoll för att detektera Pneumocystis jirovecii DNA i paraffininbäddade lungvävnadsprover. J. Eukaryot. Microbiol. 53 (Suppl 1): S98 – S99 (2006).

    Fietto, J.L., DeMarco, R. & Verjovski-Almeida, S. Användning av degenererade primers och touchdown-PCR för konstruktion av cDNA-bibliotek. Biotekniker 32, 1404–1408, 1410–1411 (2002).

    Piraee, M. & Vining, L.C. Användning av degenererade primrar och touchdown-PCR för att amplifiera ett halogenasgenfragment från Streptomyces venezuelae ISP5230. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29, 1–5 (2002).

    Levano-Garcia, J., Verjovski-Almeida, S. & da Silva, A.C. Kartläggning av transposoninsättningsställen genom touchdown-PCR och hybriddegenererade primrar. Biotekniker 38, 225–229 (2005).

    Kornmann, B., Preitner, N., Rifat, D., Fleury-Olela, F. & amp; Schibler, U. Analys av cirkadisk levergenuttryck med ADDER, en mycket känslig metod för visning av differentiellt uttryckta mRNA. Nukleinsyror Res. 29, E51 – E51 (2001).

    Ding, W., Zou, H., Dai, J. & amp Duan, Z. Kombination av restriktionssmältning och touchdown PCR möjliggör detektion av spårisoformer av histamin H3 -receptor. Biotekniker 39, 841–845 (2005).

    Li, J., Kuang, K., Nielsen, S. & amp Fischbarg, J. Molekylär identifiering och immunolokalisering av vattenkanalproteinet aquaporin 1 i CBCEC. Investera. Oftalmol. Vis. Sci. 40, 1288–1292 (1999).

    Ault, G.S., Ryschkewitsch, C.F. & Stoner, G.L. Typspecifik amplifiering av viralt DNA med hjälp av touchdown och varmstart-PCR. J. Virol. Metoder 46, 145–156 (1994).

    Roux, K.H. Enstegs PCR-optimering med hjälp av touchdown och stepdown PCR-programmering. Metoder Mol. Biol. 192, 31–36 (2002).

    Strauss, W.M. Framställning av genomiskt DNA från däggdjursvävnad. Curr. Protokoll. Mol. Biol., Kapitel 2, enhet 2.2 (2001).

    Chomczynski, P. & amp Sacchi, N. Enstegsmetoden för RNA-isolering genom sur guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformextraktion: tjugo år sedan. Nat. Protokoll. 1, 581–585 (2006).

    Rozen, S. & Skaletsky, H. Primer3 på WWW för allmänna användare och för biologprogrammerare. Metoder Mol. Biol. 132, 365–386 (2000).

    Juryev, A.E. PCR Primer Design (red. Yuryev, A.) (Humana Press, Totowa, NJ, 2007).

    Brody, J.R., Calhoun, E.S., Gallmeier, E., Creavalle, T.D. & amp Kern, S.E. Ultrasnabb högupplöst agaroselektrofores av DNA och RNA med ledande media med låg molaritet. Biotekniker 37, 598, 600, 602 (2004).

    Brody, J.R. & Kern, S.E. Historia och principer för ledande media för standard DNA -elektrofores. Anal. Biochem. 333, 1–13 (2004).

    Mokaddas, E., Ahmad, S. & amp Abal, A.T. Molekylärt fingeravtryck av isoniazidresistent Mycobacterium tuberculosis isolat från sjukhus för bröstsjukdomar i Kuwait. Microbiol. Immunol. 46, 767–771 (2002).

    Ahmad, S., Mokaddas, E. & amp; Jaber, A.A. Snabb upptäckt av etambutolresistent Mycobacterium tuberculosis stammar genom PCR-RFLP-inriktning på embB-kodon 306 och 497 och iniA-kodon 501-mutationer. Mol. Cell. Sonder 18, 299–306 (2004).

    Ahmad, S. & amp Mokaddas, E. Förekomsten av sällsynta rpoB-mutationer i rifampicinresistenta kliniska Mycobacterium tuberculosis isolerade från Kuwait. Int. J. Antimicrob. Agenter 26, 205–212 (2005).

    Mokaddas, E. & amp; Ahmad, S. Artspektrum av icke -tuberkulösa mykobakterier isolerade från kliniska prover i Kuwait. Curr. Microbiol. 56, 413–417 (2008).

    Harboe, M. et al. Korsreaktion mellan däggdjurscellinträde (Mce) proteiner av Mycobacterium tuberculosis. Skandera. J. Immunol. 56, 580–587 (2002).

    Ahmad, S., El-Shazly, S., Mustafa, A.S. & amp Al-Attiyah, R. Däggdjurscellinträdesproteiner kodade av mce3-operon av Mycobacterium tuberculosis uttrycks vid naturlig infektion hos människor. Skandera. J. Immunol. 60, 382–391 (2004).


    INTRODUKTION

    Många genotypningsprotokoll för gnagare är baserade på polymeraskedjereaktion (PCR) amplifiering av gener eller genetiska markörer, eftersom PCR är enkelt, snabbt, känsligt och kostnadseffektivt. Felaktigt betraktas PCR -genotypning ofta som ett enkelt och enkelt steg i verkligheten, men att ge robusta, exakta och snabba resultat är ofta mer utmanande än det verkar. På grund av sin höga känslighet utsätts PCR för frekventa falska positiva resultat (dvs amplifiering av en kontaminant). Omvänt, på grund av dess låga tolerans för inhibitorer, påträffas också frekventa falska negativa resultat (d.v.s. ingen amplifiering Bacich, Sobek, Cummings, Atwood, & O'Keefe, 2011 Schrader, Schielke, Ellerbroek, & Johne, 2012). PCR kan också misslyckas med att förstärka vissa mallar, till exempel GC-rika sekvenser eller sekundära strukturer. Även om det är en rutinteknik i musforskningslaboratorier, är upprättandet av tillförlitliga, snabba och kostnadseffektiva genotypningsprotokoll för varje mutation i allmänhet lågt på prioriteringslistan för vetenskapliga forskare. Forskare är mycket uppmärksamma på tillförlitligheten av data från sina experimentella protokoll, men genotypen av de använda djuren verifieras inte alltid.

    Analys av vår genotypning under en 5-årsperiod indikerade att ∼6% av djuren som provades och genotypades två gånger hade olika genotypresultat (tabell 1). När fenotyperingskohorter (grupper bestående av sex till åtta djur per genotyp och kön) togs och genotypades två gånger före och efter fenotypning, visade sig 30% inkludera minst ett djur med en överensstämmande genotyp (data visas inte). Dessa data överensstämmer med upptäckten att över 15 % av raderna som deponerats till offentliga arkiv, såsom Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRCs) och Jackson Laboratory (JAX), inte bär den mutation som specificerats av insättaren (Lloyd, Franklin, Lutz och Magnuson, 2015). Oöverskådlig genotypning är en faktor som kan påverka prekliniska studier och grundforskningens reproducerbarhet, vilket bidrar till "reproducerbarhetskrisen" (Cinelli, Rettich, Seifert, Bürki, & Arras, 2007 Picazo & García-Olmo, 2015). Dessutom kan genotypningsfel leda till genetisk kontaminering av bestånd och till och med utrotning av en genetiskt unik muslinje (Lloyd et al., 2015). Kryokonservering av mutanta spermier eller embryon och PCR -kvalitetskontroll av de bevarade bestånden är därför avgörande (Scavizzi et al., 2015). Slutligen har utvecklingen av CRISPR/Cas9 -teknik förbättrat möjligheten att uppnå mutationer hos möss (Birling, Herault, & Pavlovic, 2017 Birling, Schaeffer, et al., 2017) men också krävt ytterligare genotypning av de resulterande musmodellerna (Birling, Schaeffer, et al., 2017 Mianné et al., 2017). Konsekvenserna av genotypningsfel och felidentifiering av djur bör inte underskattas och måste kontrolleras genom effektiv och robust PCR -genotypning (Bonaparte et al., 2013).

    Jämförelse mellan de två resultaten
    År Totalt analyserade djur Djur genotypade med två oberoende biopsierb b Analysen omfattade endast de djur för vilka resultaten av båda genotyperna var tolkbara (ingen PCR -hämning eller PCR -kontaminering observerades).
    Bekräftade genotyper Tydliga genotyper Otydliga genotyper (%)
    2013 56,331 4140 3867 273 6.6
    2014 51,309 4588 4328 260 5.7
    2015 58,250 7166 6673 493 6.9
    2016 50,267 4411 4152 259 5.9
    2017 51,272 6900 6576 324 4.7
    • a Vi analyserade genotypresultaten för djur som provtagits och genotypats minst två gånger av olika skäl: t.ex. genotypverifiering före eller efter fenotypningsexperiment eller före mutantlinjefrysning eller transport.
    • b Analysen inkluderade endast de djur för vilka resultaten av båda genotyperna var tolkbara (ingen PCR-inhibering eller PCR-kontamination observerades).

    Baserat på vår expertis inom standardiserad och high-throughput genotypning (60 000 djur per år för hundratals olika genetiska markörer eller genmutationer), beskriver vi här några rekommendationer och protokoll för reproducerbar PCR-genotypning. Upprättandet av en robust genotypningsstrategi börjar med valet av vävnad som ska provas, verifiering av prover före direkt DNA-lys och slutligen tillförlitlig, snabb och kostnadseffektiv testning. Den sista delen av denna artikel beskriver hur man översätter en procedur till PCR med hög genomströmning, inklusive rekommendationer för miniatyrisering och automatisering av reaktionsblandningar. De fyra protokollen som presenteras i detta dokument är optimerade för de vanligaste proverna som används för genotypering av transgena möss: DNA i råolja extraherat från svans-, öron- eller tåvävnad, med specifika tillstånd enligt dina lokala etiska regler.

    1: METODER OCH FÖRFARANDE FÖR PROVNING AV VÄVS

    Det finns flera sätt att få DNA för genotypning av mus: svansbiopsi, öron- eller tåklippning, hår, blod eller fekala eller orala prover. Den valda metoden beror på flera parametrar, inklusive den etablerade praxisen i ditt laboratorium eller institut och mängden DNA som krävs för analysen. Tabell 2 beskriver de olika vävnader som vanligtvis används som prover för genotypning och de viktigaste övervägandena för att välja den lämpligaste provtagningsmetoden.

    • Pinna öra innehåller huvudsakligen brosk.
    • 2 Om öronprovtagning också används som identifieringsmetod kommer det inte att vara möjligt att göra en andra biopsi.
    • 3 Att samla avföring från möss yngre än avvänjningsåldern (3 veckor) är svårt på grund av deras mjölkdiet och resulterar i dåligt DNA -utbyte på grund av liten provstorlek.
    • 4 Avföringsvikt från en 4-veckors gammal mus (∼10 mg) är mycket mindre än från en vuxen (∼35 mg)
    • Rätt träning krävs för att undvika felaktig punktering och/eller blödningar.
    • 5 ≤10% av den totala blodvolymen bör tas vid varje tillfälle.
    • 6 ≤15% av den totala blodvolymen under en 28-dagarsperiod.
    • Hög risk för korskontaminering mellan prover från olika djur eftersom hårstrån fastnar elektrostatiskt vid instrument.
    • 7 Hår växer vanligtvis vid ~10 dagars ålder.
    • 8 En hårtuss representerar ~3-30 pälshår.
    • 9 Även om det inte är invasivt verkar det vara lika påfrestande som provtagning från svansen eller örat.
    • Provet bör innehålla celler av buckal mucosa. inte tungan.

    Material

    • 70% (volym/volym) etanol
    • 0,75 ml skruvlockrör (t.ex. Matrix-rör, blank kat. Nr. 446015, Dutscher) och lock (t.ex.
    • Sterila kompresser
    • Djur för vävnadsinsamling
    • Klass II mikrobiologiskt säkerhetsskåp eller omklädningsstation
    • Personlig skyddsutrustning: labbrock, handskar
    • Öronstans för möss (t.ex. kat.nr AT7020, Agnthos) eller vass kirurgisk sax (t.ex. kat. Nr 14106-09, Fine Science Tools)
    • Rengör burar

    Beredning av material

    1. Slå på säkerhetsskåpet eller bytestationen fem minuter innan proceduren påbörjas.

    2. Rengör arbetsytan med 70% etanol.

    3. Placera följande utrustning på arbetsytan: stativ med skruvlocksrör, ren bur, kompress indränkt i 70 % utspädd etanol och sax eller öronslag.

    4. Placera buren med djuren som ska provtas under säkerhetsskåpet eller omklädningsstationen och öppna den.

    5. Överför föräldrarna (om sådana finns) till den rena buren. Djur som ska genotypas placeras individuellt i buren efter varje biopsi.

    Kontrollera att djuren som behöver identifieras (antal, kön) motsvarar de som anges på genotypningsförfrågan.

    Förberedelse av sterila verktyg för biopsiprocedur

    Användning av sterila verktyg för biopsi är avgörande (se Kritiska parametrar). Öronstämpeln eller saxen måste desinficeras med en lämplig metod (t.ex. med 70% etanol).

    6. Desinficera saxen eller öronstansaren med kompressen blöt i 70% etanol.

    7. Rengör saxen eller öronstansen mellan mössen för att undvika provkontamination.

    Var uppmärksam på att vara säker på att du tar bort all vävnad från instrumenten efter varje djur (se Felsökning).

    Provtagningsförfarande

    8. Kontrollera att röret som provet ska placeras i är rent och korrekt märkt.

    9. Håll musen manuellt mellan tummen och pekfingret.

    Skonsam hantering är av stor vikt för att minska stressen av interventionen för djur (Cinelli et al., 2007).

    10. Använd den sanerade vassa saxen eller öronstansen, skär ut en bit vävnad, av homogen storlek i förhållande till andra prover (lämpliga storlekar: svansbiopsi, 5 mm öronstans, 2 mm hål i tån, en distal falang, se Kritiska parametrar ).

    11. Placera den provtagna valpen i den rena buren tillsammans med sina föräldrar.

    12. För varje mus, placera provet i motsvarande rör.

    13. Stäng röret och kontrollera att biopsin finns i rörets botten.

    14. När alla möss har provtagits kan rören lagras vid -20 ° C för senare genotypning.

    2: PROVVERIFIERING OCH DNA-LYS

    Det finns många alternativa protokoll som kan användas för att förbereda prover för PCR. De sträcker sig från användningen av ett rått lysat till en mängd olika reningsprotokoll (t.ex. organisk extraktion med fenol/kloroform eller kiseldioxidkolonn) utformad för att avlägsna föroreningar och hämmare. Rengöringsprotokoll har de nackdelarna att de är dyra, kan ha låg prestanda (Miller, Bryant, Madsen och Ghiorse, 1999) och är ganska svåra att implementera på en arbetsstation. Däremot är direkt lyseringsmetoder snabba, enkla och billiga, men tar inte bort inhibitorer och kan därför inte användas för alla tillämpningar. Här kommer vi att beskriva användningen av DirectPCR -lysreagenser med tillsats av proteinas K för rutinmässig DNA -isolering. I våra händer ger detta tillvägagångssätt en låg nivå av PCR -fel för standard PCR -genotypning (tabell 3, andel misslyckad genotyp) och goda DNA -utbyten (tabell 3, genomsnittlig mängd DNA erhållet).

    Dessa tre slags vävnadsbiopsier ger tillräckligt med DNA för PCR -genotypning. Deras prestanda i PCR är ganska lika eftersom andelen misslyckad genotypning är mycket lika, vilket indikerar att liknande nivåer av inhibitorer finns i råextrakten. Data samlades in från 27 070 svans-, 8470 öron- och 2900 tåbiopsier för att uppskatta genotypningsfel.


    Extraktionsmetod Genomsnittlig mängd DNA erhållet b b

    Mängden isolerat DNA bestämdes genom spektrofotometri med ett NanoDrop ND-1000-system (N = 5).


    Andel misslyckad genotypning c c

    Andel biopsier som inte kunde genotypas (data från 2018) eftersom resultaten inte gick att tolka. Orsakerna är multifaktoriella och inkluderar okalibrerad biopsi, ineffektiv lysering och närvaro av inhibitorer i råextraktet.

    Dessa tre typer av vävnadsbiopsier ger tillräckligt med DNA för PCR-genotypning. Deras prestanda i PCR är ganska lika eftersom andelen misslyckad genotypning är mycket lika, vilket indikerar att liknande nivåer av hämmare finns i råextrakten. Data samlades in från 27 070 svans-, 8470 öron- och 2900 tåbiopsier för att uppskatta genotypningsfel.

    Mängden isolerat DNA bestämdes genom spektrofotometri med ett NanoDrop ND-1000-system (N = 5).

    Procentandel biopsier som inte kunde genotypas (2018 -data) eftersom resultaten inte var tolkbara. Orsakerna är multifaktoriella och inkluderar okalibrerad biopsi, ineffektiv lysering och närvaro av inhibitorer i råextraktet.

    Material

    • Rör som innehåller vävnadsprover från mus (Grundprotokoll 1)
    • DirectPCR-lysreagens (musstjärt 102-T, Viagen)
    • 10 mg/ml proteinas K (lös upp 1 g frystorkat proteinas K-pulver [kat.nr P6556, Merck] i 100 ml vatten för att erhålla en klar lösning om så önskas, förvara alikvoter i 1,5 ml rör (t.ex. kat. 72.690001 , Sarstedt) vid -20°C)
    • Manuella pipetter
    • Centrifuger (t.ex. Allegra 25R centrifug Beckmann Coulter)
    • Uppvärmt vattenbad (t.ex. GLF 1083), 85 ° C
    • Uppvärmning av ugn (t.ex. Memmert), 55°C
    • Personlig skyddsutrustning: labbrock, handskar

    Verifiera visuellt varje rör som ska bearbetas

    1. Kontrollera att endast ett prov finns i röret.

    Kontrollera att biopsin i röret motsvarar den förväntade typen av prov (dvs svans, öronhål, etc.). Se figur 1 som visar öron- och svansbiopsier.

    2. Kontrollera visuellt att vävnadens storlek motsvarar den rekommenderade storleken (se tabell 2 för rekommenderade storlekar). Om inte, markera röret för senare justering av lyseringsbuffertvolymen.

    Förbered buffertar

    3. Förbered en förblandning av lysbuffert: Tillsätt 200 | il DirectPCR -lysreagens (musstjärt) och 6 | il 10 mg/ml proteinas K -lösning (10 mg/ml) per reaktion.

    En sådan förblandning är stabil i minst 24 timmar vid 4°C.

    Inkubera och lysera prov

    4. Till varje prov, tillsätt 200 μl förblandningslysbuffert för en 0,5 cm svansbiopsi eller 100 μl för en 0,2 cm öronstans- eller tåbiopsi.

    För okalibrerad biopsi, minska eller öka förblandningens lysbuffertvolym proportionellt.

    5. Förslut hermetiskt rören.

    6. Centrifugera rör 2 min vid 4000 × g, rumstemperatur.

    7. Kontrollera att biopsierna är i botten av röret och täckta av lösningen.

    8. Inkubera över natten vid 55 ° C i en uppvärmningsugn.

    9. Ta bort rören och kontrollera att de fortfarande är hermetiskt förslutna.

    10. Skaka kraftigt genom att vända.

    Biopsin måste dissociera i röret, vilket indikerar att lysen fungerade. Om biopsin inte dissocierar (indikerar ineffektiv lys), ta bort lysbufferten och upprepa steg 4-10 (dvs provinkubation med en ny förblandningsbuffert).

    Inaktivera proteinas K

    11. Inkubera rör vid 85°C i ett uppvärmt vattenbad i 45 minuter till 1 timme för att inaktivera proteinas K.

    12. Centrifugera rör 2 min vid 4000 × g, rumstemperatur.

    Dessa råextrakt är stabila i 2 veckor vid 4°C.

    3: DESIGN AV EN GENOTYPINGSTRATEGI

    En genotypningsanalys måste tillhandahålla en snabb och kostnadseffektiv metod för att identifiera djur. Det måste också vara tillförlitligt och robust, eftersom det kommer att användas för att välja mutanta djur för experiment och för att säkerställa integriteten hos en unik genetisk resurs (dvs. djur för framtida produktion, för kryokonservering eller för att tas emot av en samarbetspartner eller resurs) ).

    Att designa genotyperingsanalyser kring markörer som finns i många transgena linjer, till exempel neomycin-selektionsmarkören, GFP eller Cre, är avskräckt eftersom det inte verifierar att du använder den förväntade mutantlinjen och inte är lämplig för genotypning av dubbel-transgena stammar som innehåller vanliga transgena markörer. Istället rekommenderas att PCR -analysen specifikt identifierar varje rad och varje möjlig allel som härrör från stammutantlinjen. Till exempel skapar International Knockout Mouse Consortium en katalog över däggdjursgenfunktioner (Meehan et al., 2017) och rapporterar genereringen av över 5 000 nya mutantstammar av mus som alla har en lacZ reporterkassett och tillhandahåller villkorlig inaktiveringspotential. Ett optimerat protokoll tillåter forskare att utvärdera alla möjliga genotyper och målhändelsens integritet (fig. 2A).

    Det rekommenderas att definiera PCR -designregler som kan tillämpas på alla protokoll (se Felsökning). Detta förenklar genotypning eftersom specifika förhållanden (reaktionsblandning, termocykelprogram, agarosgelanalys) inte krävs för något projekt, och det gör att flera mutanta linjer kan analyseras i samma experiment. Denna strategi rekommenderas särskilt när stora volymer och/eller hög genomströmning är inblandade.

    Material

    • Biologiskt material: alikvot från råprovlysat, som ska användas som mall för PCR -typning
    • Primers för musspecifikt mål av intresse
    • Master mix: t.ex. FastStart PCR Master (50 ml kat. Nr 4710452001, Merck)
    • 20× hastighetsbuffert (SB), framställd enligt beskrivning av Zhang, Wang, & Wang (2011) med borsyra (kat.nr 5935, Euromedex), natriumhydroxid (kat.nr 06203, Merck) och etidiumbromid (kat. . nr EU0170, Euromedex)
    • Vatten, PCR-kvalitet (för primerutspädning och reaktionsfyllning)
    • Hjälpmedel (valfritt): 5% (volym/volym) dimetylsulfoxid (DMSO, t.ex. kat.nr.D8418-100ML, Merck), 5% (volym/volym) glycerol (t.ex. kat. Nr. 15524-1L-R, Merck) eller 0,5 µg/µl bovint serumalbumin (BSA t.ex. kat.nr B9001S, New England Biolabs) i slutlig reaktionsvolym
    • Agaros, DNA -kvalitet (t.ex. kat.nr. D5, Euromedex)
    • Hemlagat fyllningsfärgämne (framställt genom att lösa 3 ml glycerol och 8 mg bromfenolblått i 7 ml H2O)
    • DNA-molekylviktsmarkör: t.ex. GeneRuler 50-bp DNA Ladder (kat.nr SM0372, Thermo Fisher Scientific)
    • Lämpliga restriktionsenzymer med buffertar som rekommenderas av leverantörer
    • 0,75 ml skruvlocksrör (t.ex. Matrix-rör, blank kat.nr. 446015, Dutscher) och kapsyler (t.ex. Sepra Seal Cap Mats kat.nr. 446045, Dutscher)
    • 1,5 ml mikrorör (t.ex. kat.nr 72.690001, Sarstedt)
    • Dator med programvara för sekvensanalyser och verktyg för primerdesign, antingen kommersiellt (t.ex. Vector NTI, SnapGene, Geneious) eller gratis (t.ex. U-GENE, BioEdit, SeaView)
    • 4titude FrameStar 96-brunnars plattor (kat. 44760, Dutscher) eller 0,2 ml PCR-rör
    • Centrifug för mikrocentrifugrör (kat. 016000, Dutscher), tillval
    • PCR -maskin (t.ex.Eppendorf termiska cykler)
    • Agarosegelelektroforesutrustning: Tank för elektrofores, stöd där gelén hälls, kammar för att bilda brunnar (där prover deponeras)
    • Förvärvsbildare med UV -ljus som excitationskälla (t.ex. U: Genius, Syngene)
    • Personlig skyddsutrustning: labbrock, handskar, skyddsglasögon
    • Manuella pipetter

    Sök efter riktade och vildtypsekvenskartor

    1. Skaffa sekvenserna av vildtyps- och mutantalleler från musleverantören.

    För att upprätta en effektiv PCR -genotypningsstrategi är det viktigt att åtminstone ha tillgång till DNA -sekvensen för den mutanta allelen. Utan denna information kan ingen specifik design göras. Så om du inte kan få den rekombinanta sekvensen från leverantören, rekommenderar vi starkt att du genererar den teoretiska sekvensen själv med hjälp av information som finns tillgänglig i motsvarande publicerade artikel. Om den rekombinanta sekvensen inte kan genereras från ett publicerat papper, se de ytterligare rekommendationerna i Critical Parameters.

    2. Kontrollera att vildtypssekvensen du har matchar den senaste versionen av Mus musculus C57BL/6J referensgenomsamling i NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?term=mus%20musculus) eller Ensembl (https://www.ensembl.org/Mus_musculus/). Om den inte gör det måste du noggrant kontrollera vildtypssekvensen.

    Genreannotering kan ändra din genstruktur. Andra bakgrunder än C57BL/6J finns också tillgängliga som vildtypsreferenser på https://www.sanger.ac.uk/science/data/mouse-genomes-project.

    3. Använd programvara för genomisk sekvensanalys (t.ex. kommersiell Vector NTI, SnapGene, Geneious eller gratis U-GENE, BioEdit eller SeaView-programvara) för att konstruera alla sekvenskartor för var och en av de alleler du behöver för att genotypa.

    Dessa programpaket låter dig planera och simulera DNA -manipulationer, visualisera öppna läsramar och primerbindningsplatser och dela kommenterade sekvensfiler med andra forskare.

    Design av genotypprimer

    Primers bör utformas för att passa de riktade sekvenserna. Det är möjligt att designa primers med en mängd olika verktyg (genomisk sekvensanalysmjukvara), eller till och med genom att följa reglerna nedan.

    Baserna G eller C vid 3' -änden tjänar som startbindningsställe för DNA -polymeraset.

    Jämförbara smälttemperaturer (Tm) för båda primrarna.

    Jämförbar Tm (inom 5 ° C från varandra) bestämmer stabiliteten för hybriderna när matchningen mellan primers och matris uppnås.

    Specifik för den lämpliga genomiska DNA -sekvensen.

    Kontrollera specificiteten för varje primer mot genomiskt DNA med NCBI Nucleotide blastn endast på Mus musculus genomet (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Du behöver inte ändra några algoritmparametrar eller programval (dvs. använda megablast).

    Specificiteten för en primeruppsättning är relaterad till huruvida primrarna kommer att binda endast till den sekvens som vi vill detektera eller även till ytterligare sekvenser.

    VARNING: Det är inte nödvändigt att det finns 100 % homologi mellan primrar och en genomisk sekvens för att icke-specifik PCR-amplifiering ska inträffa. Primers med ett fåtal felparningar eller med en ospecifik 5′-ände kan ge upphov till ospecifika amplifieringar.

    Inga inre sekundära eller primer-primer-annealingsstrukturer.

    Intern sekundär struktur kan kontrolleras med hjälp av primer-designprogramvara (t.ex.OligoArchitect från Sigma-Aldrich) för att analysera duplexbildning.

    Primerpar bör sakna betydande inre sekundärstruktur för att undvika invändig vikning. Primer-primer-glödgning orsakad av homologi inom primerparet skapar primerdimerer och stör amplifieringsprocessen och ska därför undvikas.

    4b. Amplikonstruktur: 100-500 bp amplikonstorlek.

    En amplikonstorlek på 100-500 bp är optimal för visualisering av PCR-fragment med användning av 2% (vikt/volym) agarosgelelektrofores. Under 100 bp är PCR -fragment svåra att separera och visualisera. Över 500 bp är PCR -effektiviteten lägre eftersom råextrakt vanligtvis är mer nedbrutet än renat DNA. Dessutom bearbetar klassiskt Taq -polymeras inte amplikoner & gt1 kb i storlek väl.

    Om amplikonets sekvens innehåller & gt60% GC, utför PCR-installationen med och utan adjuvanser (enligt beskrivning i felsökning) eller till och med med ett specifikt GC-rikt polymeras (leverantörer tillhandahåller en rad specifika DNA-polymeras avsedda för specialiserade behov som GC -rik förstärkning).

    Om möjligt, undvik dinukleotidrepetitioner (t.ex. GCGC eller ATAT) och enkelbaserade körningar (t.ex. AAA eller CCC) i den förstärkta sekvensen, eftersom dessa kan orsaka hårnålsslingestrukturer.

    5. Välj den bästa primerpositionen på vildtyps- eller mutantallel(erna).

    Idealiskt är primerpositionen optimerad så att primern kan användas som ett primerpar för olika PCR-analyser. Genom att kombinera vanliga primers med olika unika primers med denna strategi kan alla möjliga alleler detekteras. Figur 2 ger ett exempel på primerdesignoptimering för genotypning av mutantmodeller genererade av International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC https://www.mousephenotype.org Meehan et al., 2017). Primers är placerade i vildtypssekvensen på DNA-regionen som skiljer sig mellan vildtypsallelen och mutantallelen(-erna). Med detta tillvägagångssätt krävs endast fyra olika primrar för att genotypa någon relevant allelkombination för en målgen. Tre ytterligare primrar utformas på mutantsekvensen. Dessa tre primrar kan användas för alla knockout-första IMPC-mutantmodeller.

    Vi rekommenderar att man designar två oberoende uppsättningar primrar per allel som ska detekteras, vilket kommer att möjliggöra musgenotypning även om en primeruppsättning inte fungerar.

    6. Frivillig: Detektera mutanta alleler med singelnukleotidpolymorfism (SNP) mutationer.

    Om din mutantallel skiljer sig från din vildtypsallel med endast en eller några punktmutationer, kommer vildtyp- och SNP-mutant PCR-amplikon att ha exakt samma storlek. Detta kommer särskilt att vara fallet om CRISPR/Cas9-genomredigering eller ENU-mutagenes har använts för att generera mutantlinjen (Birling, Herault, et al., 2017). I det här fallet måste PCR-produkter sekvenseras med hjälp av Sanger-sekvensering (Dorit, Ohara, Hwang, Kim, & Blackshaw, 2001) eller en speciell SNP-detektionsmetod som används (t.ex. TaqMan, pyrosequencing, etc).

    Eftersom PCR-produktsekvensering förblir dyr och tidskrävande, särskilt om många mutanter behöver screenas, kan det vara användbart när man skapar CRISPR/Cas9-musmodellen för att infoga ett restriktionsställe som inte ändrar genproteinsekvensen (en tredje nukleotidtriplett). synonymt substitution som inte förändrar aminosyran som kodas). Denna restriktionsplats kan sedan användas för diagnostisk rötning av PCR -produkten (steg 25).

    7. Verifiera att varje PCR-amplikon producerar en storlek som lätt kan separeras på 2 % agarosgel.

    Vissa primerpar kan användas för att detektera olika alleler (se fig. 2B), men storleken på PCR -amplikonet måste skilja sig åt med minst 50 bp för att korrekt kunna särskilja varje amplikon.

    8. Beställ primers från vilken leverantör som helst.

    Standard PCR kräver inte högkvalitativ primersyntes. Du kan välja vilken leverantör som helst och använda avsaltad rening.

    9. Späd primers till 100 µM i PCR-grad H2O och förvara vid -20 ° C.

    Uppställning av polymeraskedjereaktion

    PCR -strategin som beskrivs nedan bör testas på tre till fem prover. Helst används en biopsi från mutanta djur för test -PCR. Om ingen biopsi är tillgänglig kan embryonala stamcellklon -DNA utspätts i råextrakt, riktningsvektor utspädd i råextrakt eller kimärbiopsi. En vävnadsbiopsi från ett vildtypsdjur bör alltid inkluderas som kontroll. På samma sätt fungerar PCR -reaktioner utan mall som en negativ (eller vatten) kontroll för att bekräfta frånvaron av PCR -kontaminering.

    10. Centrifugera rör som innehåller biologiska prover i 2 minuter vid 4000 × g, rumstemperatur, till sedimentskräp.

    11. Förbered PCR-reaktionerna enligt beskrivningen nedan, antingen i ett sterilt 1,5 ml-rör för några prover eller i en 96-brunnsplatta för större provtal.

    Eftersom enzymet som används i detta protokoll är ett varmstartspolymeras, kan PCR-reaktionsblandningen beredas vid rumstemperatur (18 ° C-25 ° C). Men om några reagenser har frysts för senare användning (t.ex. reaktionsblandning eller primers), bör rören tinas långsamt på is.

    Mängden av varje reagens som tillsätts till masterblandningen motsvarar det totala antalet volymreaktioner plus 10% avrundat till närmaste hela reaktion (för att ta emot förlust av pipettöverföring).

    Tillsätt 14 µl mastermix (FastStart PCR Master, Roche) per tub eller brunn.

    Genom att använda en färdigblandad blandning av enzymet, dNTP och reagenser, såsom FastStart PCR -master, minimeras fel och kontamineringsrisk och reduceras tiden för PCR -beredning.

    12. Tillsätt 3 µl råextrakt och sedan 22 µl PCR-reaktionsblandning till varje 0,2 ml PCR-rör eller varje brunn i en 96-brunnar.

    13. Blanda noggrant genom att försiktigt pumpa en mikropipets kolv upp och ner två eller tre gånger.

    14. Förbered en negativ kontroll: Lägg till alla reagenser med undantag för DNA -mallen (öka vattnet för att kompensera för den saknade volymen).

    15. Förslut rören eller plattan.

    16. Centrifugera reaktionsblandningen kort så att den faller till botten av röret eller plattan.

    17. Sätt in PCR-rör eller -plattor i termocyklern och påbörja PCR-programmet enligt parametrarna som beskrivs i Tabell 4.

    Genom att utveckla standardvillkor som gäller för alla mutantmodeller kan alla prover bearbetas tillsammans oavsett projekt.

    Dessa cykelförhållanden fungerar bra med våra protokoll (grundprotokoll 3 och 4) men kan kräva modifiering om andra förhållanden (t.ex. annat Taq-polymeras) används.

    Temperatur Tid Antal cykler
    95 ° C 4 min 1 94 ° C 30 s 62°C 30 s 34 72 ° C 1 min 72 ° C 7 min 1 20 ° C 5 min 1

    Dessa cykelförhållanden fungerar bra med våra protokoll (grundprotokoll 3 och 4) men kan kräva modifiering om andra förhållanden (t.ex. annat Taq -polymeras) används.

    Bildinsamling och analyser

    PCR -amplikoner separeras med en 2% agarosgel och resultaten visualiseras med en digitalkamera.

    18. Späd 20 × koncentrerat SB -lager till 1 × som ska användas för att tillverka och köra gelén.

    Denna buffert låter dig köra en DNA -gel vid höga spänningar utan att överhettas och smälta din gel.

    19. Bered en 2% (vikt/volym) gelagaros innehållande 1 × SB. Före polymerisation, använd handskar och skyddsglasögon, tillsätt 15 µl 10 mg/ml etidiumbromidförråd per 600 ml agarosgel i lösningen. Skaka långsamt utan att göra bubblor.

    Ju högre agaroskoncentration, desto mindre porer skapas i gelmatrisen och desto svårare är det för stora linjära DNA-molekyler att röra sig genom matrisen. Ändring av agaroskoncentrationen ändrar storleken på gelens siktmatris. 2% gel är väl anpassad för 100- till 500-bp PCR-produkter.

    20. För att förbereda PCR -prover för migration, tillsätt 5 µl hemlagat fyllningsfärg till 15 µl PCR -reaktion.

    21. Fyll försiktigt på proverna i gelens brunnar.

    För att approximera storleken på amplikonerna tillsätts kommersiellt tillgänglig DNA -molekylviktsmarkör i varje ände av en rad (3,5 | il per brunn).

    22. Kör gelén vid 280 V (400 mA, 100 W) tills färglinjen är cirka 80% av vägen ner i gelen.

    En typisk körtid är ∼45 min, beroende på gelstorleken.

    23. Använd en digitalkamera (U: Genius) för att visualisera DNA -fragmenten.

    Om en PCR-produkt finns närvarande kommer etidiumbromiden att interkalera mellan baserna av DNA-strängarna, vilket gör att band kan visualiseras med en UV-belysning.

    Spara och arkivera alltid den resulterande bilden. Du kan till exempel behöva kontrollera om det finns genotypningsfel eller tillhandahålla den här bilden för publicering.

    Analysvalidering

    24. Kontrollera att varje amplikonband motsvarar den förväntade storleken för varje analys. Verifiera frånvaron av ytterligare band.

    Om ja, valideras PCR -inställningen och primerparen bör väljas för genotypning.

    Det slutliga protokollet du har utformat kan nu användas för genotypning av dina djur.

    Om inte, bör nya primersatser testas.

    Se Kritiska parametrar för ytterligare lösningar för PCR-inställning.

    Ytterligare steg för SNP-mutationsdetektion via diagnostisk digerering

    Om vildtyp och mutant PCR-amplikon har samma storlek (se steg 6) kan PCR-produktklyvning med restriktionsenzym utföras för att differentiera de två amplikonerna.

    25. Kontrollera närvaron av DNA-amplikoner efter PCR genom elektrofores enligt detaljerna i steg 18-23 men med endast 5 µl av PCR-reaktionen i steg 20.

    Tillsätt komponenter i följande ordning: 2,5 µl av 10× bufferten som levereras med enzymet, 1 µl restriktionsenzym och 11,5 µl vatten.

    Mängden restriktionsenzym du använder för en given digestion kommer att bero på mängden DNA du vill skära. Per definition kommer en enhet enzym att skära 1 µg DNA i en 50 µl reaktion på 1 timme. Reaktioner utförs ofta med 0,5-1 µl enzym.

    27. Inkubera rören vid smältningstemperatur (vanligtvis 37°C) i 1 timme.

    Inkubationstiden kan variera från 45 minuter till över natten. För diagnostiska smältningar är 1-2 timmar ofta tillräckligt.

    28. Visualisera de smälta PCR-produkterna genom migration på en agarosgel enligt beskrivningen i steg 18-23.

    4: GÅR TILL GENOTYPING MED HÖG GENOMGÅNG

    Alla klassiska genotypningsmetoder har relativt låg genomströmning. Automatisering av genotypning genom användning av en arbetsstation möjliggör parallell genotypning av ett stort antal genetiska modifieringar, på många genetiska platser, hos många individer. Förutom att förbättra genomströmningen minskar automatiseringen risken för kontaminering och fel genom att begränsa pipetteringssteg och förhindra rörbyte. Den konventionella endpoint PCR-metoden är lätt anpassad för automatisering och är verkligen en effektiv, beprövad och prisvärd metod för screening med hög genomströmning. Dessutom kan PCR-analyser miniatyriseras i 384-brunnars plattor på en arbetsstation, vilket minskar kostnaden för genotypning av djur.

    Att utveckla ett Laboratory Information Management System (LIMS) för att effektivt hantera arbetsstationer, prover och tillhörande data är också viktigt (fig. 3 kritiska parametrar).

    Material

    • Biologiskt material: Rått provlysat i 96-rörsställ
    • Primers för musspecifikt mål av intresse
    • Vatten, PCR-kvalitet (för primerutspädning och reaktionsfyllning)
    • FastStart PCR Master (50 ml kat. Nr 4710452001, Merck)
    • Adjuvans: 5% (volym/volym) DMSO (kat.nr D8418-100ML, Merck), 5% (volym/volym) glycerol (kat. 15524-1L-R, Merck) eller 0,5 µg/µl BSA (kat.nr B9001S, New England Biolabs)
    • Arbetsstation eller flytande hanterare (t.ex. Freedom EVO200, Tecan eller STARplus, Hamilton Microlab)
    • 4titude FrameStar 384-brunnars PCR-plattor (kat.nr 384 44751, 4titude)
    • 8-Strip PCR-rör med lock (t.ex. kat.nr 016000, Dutscher)
    • 15 ml koniskt rör (t.ex. kat.nr 352097, Corning)
    • Integrerad centrifug (t.ex. Sias)
    • Integrerad värmeförseglare (t.ex. PlateLoc, Agilent
    • Tätningsbar film, klar tätning (kat.nr 4Ti-0542, 4titude)
    • PCR termocykler med motoriserat uppvärmt lock (t.ex. T-robot, Biometra)
    • Manuella pipetter

    Utformning av genotypningsstrategi och analysvalidering

    1. Följ steg 1-9 i Basic Protocol 3 för att utforma en genotypningsstrategi med hög genomströmning.

    Vi rekommenderar också starkt att du följer rekommendationerna i Kritiska parametrar (avsnittet om viktiga rekommendationer för utformning av genotypningsstrategi för högkapacitetsarbetsflöde) för att garantera framgångsrik automatisering med hög genomströmning.

    2. För analysvalidering, följ steg 10-24 i Basic Protocol 3. Använd villkoren som beskrivs i Tabell 5 för 384-brunnars plattor.

    Validering av genotypningsstrategi med hög genomströmning måste göras i 384-brunnars plattformat eftersom PCR-förhållandena för 96-brunnars plattor inte alltid är proportionellt tillämpliga i 384 brunnar.

    Reagens Volym för 384-brunnars platta Volym för plattan med 96 brunnar
    FastStart PCR Master (Roche) 7,5 ul 14 µl
    Råextrakt 1,5 | il 3 ul
    5′ primer (100 mM) 0,06 ul 0,2 ul
    3 ′ primer (100 mM) 0,06 | il 0,2 ul
    Steril H2O Upp till 15 µl Upp till 25 µl

    Förbered den automatiserade PCR -körningen

    Vi presenterar här det protokoll som används på våra två arbetsstationer (Tecan Freedom EVO 200/8 och Hamilton Microlab STARplus). Detta protokoll måste anpassas till varje installation enligt dina specifika arbetsstationsspecifikationer.

    3. Slå på arbetsstationen, den tillhörande datorn och alla integrerade instrument.

    4. Öppna programvaran som styr arbetsstationen (t.ex. Freedom EVOware for Freedom EVO 200/8 Tecan eller VENUS programvara för STARplus Hamilton).

    5. Initiera instrumentet.

    Initieringssekvensen används för att kalibrera robotarmsrörelserna, d.v.s. för att bestämma referenspositionerna (noll) längs x-, y- och z-axlarna.

    Denna funktion använder en tvättstation för att spola ut spädarna och slangen (fyll dem med systemvätska) och för att tvätta de tvättbara nålarna (eller spetsarna) på pipetteringsarmen.

    7. Ladda eller skapa arbetslistan.

    Arbetslistan är en fil som innehåller kommandon som säger instrumentet vad och var de ska pipetteras. Filen innehåller information om käll- och destinationspositioner och de volymer som ska pipetteras.

    1. Om du har utvecklat ett LIMS för att hantera ditt prov (se Kritiska parametrar), ladda din arbetslista med hjälp av programvaran som styr arbetsstationen.
    2. Om inte, generera arbetslistan enligt arbetsstationens leverantör.

    Ladda reagenser, rör och plattor på robotens arbetsbord

    En visualisering av arbetsbordet (i arbetsbordsfönster) genereras av mjukvaran som styr arbetsstationen efter steg 7. Detta fönster representerar instrumentets arbetsyta (däck). Följ indikationerna på skärmen för att placera alla reagenser, rör och plattor.

    8.Placera alla 96-rörsställ som innehåller råextrakt på arbetsstationen enligt arbetsbordsfönstren.

    9. Placera primerset som beskrivs i arbetsbordets fönster.

    Vi rekommenderar att du förbereder primeruppsättningarna i en 8-rörsremsa (se Kritiska parametrar).

    1. Förbered 12-24 rörremsor per mutantlinje och förvara dem vid -20 ° C.
      1. Tillsätt 6,5 µl var och en av 100 mM framåt och bakåt primrar per mikrorör.
      2. Komplettera med 187 µl sterilt vatten per mikrorör.
      3. Upprepa detta steg för alla PCR-uppsättningar som används för genotypning av mutantlinjerna (upp till åtta PCR per muslinje).
        Tillsätt 3,3 ml FastStart PCR Master och 1,7 ml sterilt vatten i ett 15 ml koniskt rör för varje 384-brunnars PCR-platta som ska genereras under körningen. Ytterligare 15 % av reaktionsblandningen ingår för att klara av pipettering.

      Placera 15 ml-röret enligt anvisningarna på arbetsbordets fönster.

      Reaktionsblandningsvolymen baseras på det totala antalet prover, antalet PCR -förstärkningar som ska utföras per prov och erforderliga reagensdödvolymer.

      11. Placera 384-brunnars PCR-plattor på de angivna platserna.

      Ställ in en PCR-körning på en automatiserad arbetsstation

      12. Starta lämpligt pipetteringsskript (t.ex. metod för PCR med plattor med 384 brunnar och tätning).

      13. Kontrollera visuellt att pipetteringsprocessen har startat korrekt innan du lämnar arbetsstationen.

      1,5 µl av det relevanta råextraktet.

      Denna pipetteringsordning (reaktionsblandning sedan primers och provråextrakt) är optimerad för att minska pipetteringssteg och varaktighet, dekontamineringssteg (blekning), spolning och risk för kontaminering.

      Efterkörningsprocess

      14. Varje platta med 384 brunnar förseglas automatiskt och centrifugeras sedan (2 minuter vid 4000 × g) och placeras i en termocykler vid griparmen. Vätskeshanteringsprogramvaran styr termocykeln och startar termocykelprogrammet (programparametrar beskrivs i tabell 4).

      15. I slutet av en körning är det möjligt att utföra en visuell inspektion för att kontrollera att alla brunnar på plattan har samma och förväntade volym.

      Bildinsamling och analyser

      16. Följ steg 18-23 i Basic Protocol 3.

      Sanering

      Vi rekommenderar att du dekontaminerar instrumentet noggrant i slutet av varje vecka, antingen genom att pipettera en 10 % utspädd blekmedelslösning eller genom att använda en UV-lampa.


      Experimentell procedur

      Smälta och rena vektor:

      Medan du väntar på att dina oligon ska anlända, genomför en restriktionssmältning av 1μg vektor med EcoRI och SalI

      Kör en agarosgel och klipp ut bandet som innehåller ditt vektor-DNA

      Gel renar ditt DNA från agarosen med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit eller standardprotokoll.

      Anneal oligos:

      Oligos bör återsuspenderas i glödgningsbuffert (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCL, 1 mM EDTA) och blandas i ekvimolära koncentrationer. Vi rekommenderar att du blandar 2μg vardera i en total volym på 50μL - tillsätt ytterligare glödgningsbuffert om det behövs för att nå 50μL. Effektiv glödgning kan uppnås med en av två metoder:

      Placera de blandade oligon i ett 1,5 ml mikrofugrör.

      Placera röret i 90-95°C varmt block och låt stå i 3-5 minuter.

      Ta bort det heta blocket från värmekällan (stäng av eller flytta blocket till bänkskivan) för långsam kylning till rumstemperatur (

      Placera blandade oligos i ett PCR -rör.

      Placera röret i en termocykler programmerad att starta vid 95 ° C i 2 minuter.

      Kyl sedan gradvis till 25 ° C under 45 minuter.

      Lagstiftning:

      Späd 5μL glödgade oligos med 45μL nukleasfritt vatten och kvantifiera koncentrationen (bör vara ca 8ng/μl).

      Blanda de glödgade oligonerna med skuren vektor i molära förhållanden (vektor:insättning) mellan 4:3 och 1:6 i en standardligeringsreaktion (t.ex. för att ligera en glödgad oligoinsats på 50 bp i längd till en 5 kb vektor, blanda 100 ng av vektor med 0,75-6 ng glödgade oligo).

      Förvandla 2-3μL till dina favoritkompetenta bakterier och tallrikar.

      Var noga med att välja flera kolonier för mini-prepping och verifiera infogning genom sekvensering.


      Titta på videon: Masshalt, volymhalt och koncentration (December 2022).