Information

Finns plasmider i eukaryoter?

Finns plasmider i eukaryoter?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Det finns några som säger att plasmider finns i vissa eukaryoter men är det som vetenskapligt bevisat?


Dessa resurser kan hjälpa.

Den här boken, "Eukaryoternas plasmider", förklarar att...

– Innehav av plasmider kändes länge bara igen hos bakterierna. Det är nu uppenbart att plasmider, eller replikativa former av DNA som är strukturellt och experimentellt jämförbara med bakteriella plasmider, finns också i eukaryota organismer. Sådana plasmider är faktiskt vanliga bland svampar och högre växter. ”

Den här webbplatsen (ScienceDirect) förklarar också att...

”De flesta plasmider lever i bakterier, och cirka 50% av bakterierna som finns i naturen innehåller en eller flera plasmider. Plasmider finns också i högre organismer som jäst och svampar. Jästcirkeln på 2 mikron (diskuteras senare) är ett välkänt exempel som har modifierats för användning som en kloningsvektor. ”


Finns plasmider i eukaryoter? - Biologi

En plasmid är en liten DNA -molekyl som är fysiskt separat från och kan replikera oberoende av kromosomalt DNA i en cell.

Lärandemål

Beskriv användbarheten av plasmider

Viktiga takeaways

Nyckelord

  • Plasmider finns i alla tre stora domänerna: Archaea, Bacteria och Eukarya. I likhet med virus anses plasmider inte av vissa vara en livsform.
  • Plasmider tillhandahåller en mekanism för horisontell genöverföring inom en population av mikrober och ger vanligtvis en selektiv fördel under ett givet miljötillstånd.
  • Plasmider kan bära gener som ger resistens mot naturligt förekommande antibiotika i en konkurrenskraftig miljönisch, eller så kan de producerade proteinerna fungera som toxiner under liknande omständigheter.

Nyckelbegrepp

  • plasmid: En cirkel av dubbelsträngat DNA som är separat från kromosomerna, som finns i bakterier och protozoer.
  • mobilome: Helheten av de mobila (transponerbara) elementen i ett genom.
  • repliker: en region av DNA eller RNA, som replikerar från ett enda replikationsursprung.

Inom mikrobiologi och genetik är en plasmid en DNA-molekyl som är separat från och kan replikera oberoende av kromosomalt DNA. De är dubbelsträngade och i många fall cirkulära. Plasmider förekommer vanligtvis naturligt i bakterier, men finns ibland i archaea och till och med i eukaryota organismer (t.ex. 2-mikrometerringen i Saccharomyces cerevisiae).

Steg för steg för att klona en gen med hjälp av en plasmid: Den här bilden visar en linjeteckning som jämför aktiviteten hos icke-integrerande plasmider på toppen, med episomer, på botten, under celldelning. Den övre halvan av bilden visar en bakterie med dess kromosomala DNA och plasmider som delar sig i två identiska bakterier, var och en med sitt kromosomala DNA och plasmider. Den nedre halvan av bilden visar en bakterie med sitt kromosomala DNA, men med en episom. Bredvid denna bakterie ser vi samma bakterie, men efter att episomen har integrerats i det kromosomala DNA: t och blivit en del av det. Denna andra bakterie delar sig nu i två bakterier som är identiska med den, var och en med en episom integrerad i den.

Plasmidstorlekar varierar från 1 till över 1 000 kbp. Antalet identiska plasmider i en enda cell kan variera allt från en till tusentals under vissa omständigheter. Plasmider kan betraktas som en del av mobilomen eftersom de ofta är förknippade med konjugering, en mekanism för horisontell genöverföring.

Termen plasmid introducerades först av den amerikanska molekylärbiologen Joshua Lederberg 1952.

Plasmider anses vara replikoner. De kan hittas i alla tre huvuddomänerna: Archaea, Bacteria och Eukarya. I likhet med virus anses plasmider av vissa inte vara en form av liv. Till skillnad från virus är de nakent DNA och kodar inte för gener som är nödvändiga för att omsluta det genetiska materialet för överföring till en ny värd, även om vissa klasser av plasmider kodar för den sexpilus som är nödvändig för deras egen överföring. Plasmid värd-till-värd-överföring kräver direkt mekanisk överföring genom konjugering, eller förändringar i begynnande värdgenuttryck som tillåter avsiktligt upptag av det genetiska elementet genom transformation. Mikrobiell transformation med plasmid-DNA är varken parasitisk eller symbiotisk till sin natur, eftersom var och en innebär närvaron av en oberoende art som lever i ett kommensalt eller skadligt tillstånd med värdorganismen. Snarare tillhandahåller plasmider en mekanism för horisontell genöverföring inom en population av mikrober och ger typiskt en selektiv fördel under ett givet miljötillstånd. Plasmider kan bära gener som ger resistens mot naturligt förekommande antibiotika i en konkurrenskraftig miljönisch, eller så kan de producerade proteinerna fungera som toxiner under liknande omständigheter. Plasmider kan också ge bakterier förmågan att fixera elementärt kväve eller att bryta ned motstridiga organiska föreningar som ger en fördel när näringsämnen är knappa.


Egenskaper för eukaryot DNA jämfört med prokaryot DNA

Prokaryota celler är kända för att vara mycket mindre komplexa än eukaryota celler eftersom eukaryota celler anses vara närvarande vid en senare utvecklingspunkt. Det är troligt att eukaryota celler utvecklats från prokaryota celler. Skillnader i komplexitet kan ses på cellnivå.

Den enda egenskapen som är både nödvändig och tillräcklig för att definiera en organism som eukaryot är en kärna omgiven av ett kärnhölje med kärnporer. Alla existerande eukaryoter har celler med kärnor det mesta av en eukaryot cell & rsquos genetiskt material finns i kärnan. Däremot finns inte prokaryot DNA i en kärna, utan är snarare fäst vid plasmamembranet och i form av en nukleoid, en oregelbundet formad region som inte är omgiven av ett kärnmembran.

Bild (PageIndex<1>): Cellulär lokalisering av eukaryot och prokaryot DNA: Eukaryot DNA lagras i en kärna, medan prokaryot DNA finns i cytoplasman i form av en nukleoid.

Eukaryot DNA är packat i buntar av kromosomer, var och en bestående av en linjär DNA -molekyl lindad runt basiska (alkaliska) proteiner som kallas histoner, som lindar DNA: t till en mer kompakt form. Prokaryot DNA finns i cirkulär, icke-kromosomal form. Dessutom har prokaryoter plasmider, som är mindre bitar av cirkulärt DNA som kan replikera separat från prokaryot genomiskt DNA. På grund av eukaryot DNA: s linjära natur finns upprepade icke-kodande DNA-sekvenser som kallas telomerer närvarande i vardera änden av kromosomerna som skydd mot försämring.

Mitos, en process av nukleär division där replikerade kromosomer delas och separeras med hjälp av element i cytoskelettet, är universellt närvarande i eukaryoter. Cytoskelettet innehåller struktur- och motilitetskomponenter som kallas aktinmikrofilament och mikrotubuli. Alla bevarade eukaryoter har dessa cytoskelettelement. Prokaryoter å andra sidan genomgår binär klyvning i en process där DNA replikeras, sedan separeras till två poler i cellen, och slutligen delar cellen sig helt.

En stor DNA -skillnad mellan eukaryoter och prokaryoter är närvaron av mitokondriellt DNA (mtDNA) i eukaryoter. Eftersom eukaryoter har mitokondrier och prokaryoter inte, innehåller eukaryota celler mitokondriellt DNA förutom DNA som finns i kärnan och ribosomerna. MtDNA består av betydligt färre baspar än kärn -DNA och kodar endast för några dussin gener, beroende på organismen.


Plasmider: definition, typer och replikering | Mikrobiologi

I denna artikel kommer vi att diskutera:- 1. Definition av Plasmider 2. Fysisk natur och kopia Antal plasmider 3. Egenskaper 4. Oförenlighet 5. Typer 6. Replikering 7. Plasmidhärdning 8. Användning av plasmider som koningvektorer.

Definition av plasmider:

Förutom bakteriekromosom (nukleoid) innehåller bakterieceller normalt genetiska element i sin cytoplasma. Dessa genetiska element existerar och replikeras separat från kromosomen och kallas plasmider. Själva existensen av plasmider i bakteriell cytoplasma avslöjades av Lederberg 1952 när han arbetade med konjugationsprocessen i bakterier.

Lederberg myntade termen ‘plasmid ’ för att hänvisa till de överförbara genetiska elementen som överfördes från en bakteriecell till en annan och bestämde maleness hos bakterier.

Bokstavligen är tusentals plasmider nu kända över 300 olika naturligt förekommande plasmider har isolerats från enbart stammar av Escherichia coli. Förutom naturligt förekommande plasmider har många artificiellt modifierade plasmider utvecklats och använts som vektorer i genkloning (genteknik).

Fysisk natur och antal kopior av plasmider:

Plasmidernas fysiska natur är ganska enkel. De är små dubbelsträngade DNA-molekyler. Majoriteten av plasmiderna är cirkulära, men många linjära plasmider är också kända.

Naturligt förekommande plasmider varierar i storlek från ungefär 1 kilobas till mer än 1 megabas, och ett typiskt plasmid -DNA anses vara mindre än 5% av bakteriekromosomens storlek. Det mesta av plasmid -DNA som isoleras från bakterieceller finns i supercoil -konfigurationen, vilket är den mest kompakta formen för DNA som finns i cellen.

Kopiantalet syftar på att olika plasmider förekommer i celler i olika antal. Vissa plasmider finns i cellen i endast 1-3 kopior, medan andra kan finnas i över 100 kopior. Antalet kopior styrs av gener på plasmiden och av interaktioner mellan värden och plasmiden.

Egenskaper hos plasmider:

(i) De är specifika för en eller några särskilda bakterier.

(ii) De replikerar oberoende av bakteriekromosomen.

(iii) De kodar för sin egen överföring.

(iv) De fungerar som episomer och integreras reversibelt i bakteriekromosomen.

(v) De kan plocka upp och överföra vissa gener av bakteriell kromosom,

(vi) De kan påverka vissa egenskaper hos bakteriecellen,

(vii) Plasmider skiljer sig från virus på följande två sätt.

(viii) De orsakar inte skador på celler och är i allmänhet fördelaktiga.

(ix) De har inte extracellulära former och existerar inuti celler helt enkelt som fritt och typiskt cirkulärt DNA.

Inkompatibilitet av plasmider:

I vissa fall innehåller en enda bakteriecell flera olika typer av plasmider. Borrelia burgdorferi som orsakar borrelia har för bekvämlighetens skull 17 olika cirkulära och linjära plasmider.

I ett tillstånd när en plasmid överförs till en ny bakteriecell som redan har en annan plasmid observeras vanligen att den andra (överförda) plasmiden inte ryms och går förlorad under efterföljande replikation.

Detta tillstånd kallas plasmidinkompatibilitet och de två plasmiderna sägs vara inkompatibla. Ett antal inkompatibilitetsgrupper av plasmider har identifierats i bakterier. Plasmiderna i en inkompatibilitetsgrupp utesluter varandra från att replikera i cellen men samexisterar i allmänhet med plasmider från andra grupper.

Plasmider från en inkompatibilitetsgrupp delar en gemensam mekanism för att reglera deras replikering och är således relaterade till varandra. Därför, även om en bakteriecell kan ha olika typer av plasmider, är var och en genetiskt distinkt.

Typer av plasmider:

Olika typer av plasmider förekommer naturligt i bakterieceller, och den mest gynnade klassificeringen av sådana plasmider är baserad på deras huvudfunktioner kodade av deras egna gener.

Följande är huvudtypen av plasmider som känns igen på basis av ovan nämnda karakteristiska egenskaper:

1. F-plasmid (eller F-faktor):

F-plasmid eller F-faktor (“F ” står för fertilitet) är den mycket väl karakteriserade plasmiden. Det spelar en stor roll vid konjugering i bakterier E. coli och var den första som beskrivs. Det är denna plasmid som ger bakteriecellerna ‘manlighet’, termen "sex-faktor" används också för att referera till F-plasmid på grund av dess denna egenskap. F-plasmid är en cirkulär dsDNA-molekyl med 99 159 baspar.

Den genetiska kartan över F-plasmiden visas i Fig. 5.31. En region av plasmiden innehåller gener involverade i reglering av DNA-replikationen (rep-gener), den andra regionen innehåller transposerbara element (IS3, Tn 1000, IS3 och IS2 gener) involverade i dess förmåga att fungera som en episom, och den tredje stora regionen, tra-regionen, består av tra-gener och har förmåga att främja överföring av plasmider under konjugering. Exempel F-plasmid av E. coli.

R-plasmider är den mest utbredda och välstuderade gruppen av plasmider som ger resistens (därav kallade resistenta plasmider) mot antibiotika och olika andra tillväxthämmare.

R-plasmider har vanligtvis gener som kodar för enzymer som kan förstöra och modifiera antibiotika. De är vanligtvis inte integrerade i värdkromosomen. Vissa R-plasmider har bara en enda resistent gen medan andra kan ha så många som åtta.

Plasmid R 100, till exempel, är en 94,3 kilobas-par plasmid (fig. 5.32) som bär resistenta gener för sulfonamider, streptomycin och spektinomycin, kloramfenikol, tetracyklin etc. Den bär också gener som ger resistens mot kvicksilver.

Många R-plasmider är konjugerande och har läkemedelsresistenta gener som transponerbara element, de spelar en viktig roll i medicinsk mikrobiologi eftersom deras spridning genom naturliga populationer kan få djupa konsekvenser vid behandling av bakterieinfektioner.

Virulens-plasmider ger patogenesitet hos värdbakterien. De gör bakterien mer patogen eftersom bakterien bättre kan motstå värdförsvar eller att producera toxiner.

Till exempel, Ti-plasmider av Agrobacterium tumefaciens inducerar kransgallsjukdom hos angiosperma växter entertoxigena stammar av E. coli orsakar resenärsdiarré på grund av en plasmid som kodar för ett enterotoxin som inducerar omfattande utsöndring av vatten och salter i tarmen.

Kol-plasmider bär gener som ger värdbakterien förmåga att döda andra bakterier genom att utsöndra bakteriociner, en typ av proteiner. Bakteriociner dödar ofta celler genom att skapa kanaler i plasmamembranet vilket ökar dess permeabilitet. De kan också bryta ner DNA eller RNA eller attackera peptidoglykan och försvaga cellväggen.

Bakteriociner verkar endast mot närbesläktade stammar. Kol El plasmid av E. coli kod för syntes av bakterioein som kallas koliciner som dödar andra känsliga stammar av E. coli. Col-plasmider av vissa E.coli kodar för syntesen av bakteriocin, nämligen cloaciner som dödar Enterobacter-arter.

Mjölksyrabakterier producerar bakteriocin NisinA som kraftigt hämmar tillväxten av en mängd olika grampositiva bakterier och används som konserveringsmedel i livsmedelsindustrin.

5. Metaboliska plasmider:

Metabola plasmider (även kallade nedbrytande plasmider) har gener som kodar enzymer som bryter ned ovanliga ämnen som toluen (aromatiska föreningar), bekämpningsmedel (2, 4-diklorfenoxiättiksyra) och sockerarter (laktos).

TOL (= pWWO) plasmid av Pseudomonas putida är ett exempel. Vissa metaboliska plasmider som förekommer i vissa stammar av Rhizobium inducerar dock knölbildning i baljväxter och utför fixering av atmosfäriskt kväve.

En kort sammanfattning av viktiga typer av bakteriella plasmider, deras värdar och egenskaper ges i Tabell 5.2.

Replikering av plasmider:

Plasmider replikerar autonomt eftersom de har sina egna replikationsursprung. Enzymerna som är involverade i plasmidreplikation är normala cellenzymer, särskilt vid små plasmider. Men vissa stora plasmider bär gener som kodar för enzymer som är specifika för plasmidreplikation.

Plasmider har relativt få gener, i allmänhet mindre än 30, och generna handlar främst om kontroll av replikeringsinitieringsprocessen och fördelning av de replikerade plasmiderna mellan dotterceller, den genetiska informationen som transporteras i plasmidgener är inte väsentlig för värden eftersom bakterierna som saknar dem fungerar normalt normalt.

Eftersom plasmid -DNA: t har liten storlek, sker hela replikationsprocessen mycket snabbt, kanske inom 1/10 eller mindre av den totala tiden för celldelningscykeln.

De flesta plasmider i gramnegativa bakterier replikerar på ett sätt som liknar replikationen av bakteriekromosom som involverar initiering vid replikationsursprungsstället och dubbelriktad replikation runt DNA-cirkeln vilket ger en theta (Ө) mellanprodukt.

Vissa plasmider av gramnegativa bakterier replikerar emellertid med enkelriktad metod. De flesta plasmider av grampositiva bakterier replikerar genom en rullande cirkelmekanism liknande den som används av fag φx174. De flesta linjära plasmider replikerar med hjälp av en mekanism som involverar ett protein bundet till 5′-änden av varje DNA-sträng som används vid priming av DNA-syntes.

Plasmidhärdning:

Plasmider kan elimineras från bakterieceller, och denna process kallas härdning. Härdning kan ske spontant eller kan induceras av olika behandlingar som hämmar plasmidreplikation men inte påverkar bakteriell kromosomreplikation och cellreproduktion. De inhiberade plasmiderna späds långsamt ut ur den växande bakteriepopulationen.

Några vanligt använda härdningsmedel är akridinfärgämnen, ultraviolett (UV) och joniserande strålning, tyminsvält och tillväxt över optimala temperaturer. Dessa härdande behandlingsmedel stör plasmidreplikationen än med bakteriell kromosomreplikation.

Användning av plasmider som kloningsvektorer:

Betydelsen av plasmider ökade dramatiskt med tillkomsten av rekombinant DNA-teknologi när de blev de första kloningsvektorerna, och även idag är de de mest använda kloningsvektorerna, särskilt vid genkloning i bakterier.

De åtnjuter denna status eftersom de har mycket användbara egenskaper som kloningsvektorer som inkluderar:

(i) Liten storlek, vilket gör plasmiden lätt att isolera och manipulera

(ii) Oberoende replikationsursprung, som tillåter plasmidreplikation i cellen att fortgå oberoende av direkt kromosomkontroll

(iii) Flera kopior, vilket gör att de finns i cellen i flera kopior så att amplifiering av plasmid -DNA blir lätt och

(iv) Närvaro av selekterbara markörer såsom antibiotikaresistensgener, som gör detektion och selektion av plasmidinnehållande kloner lättare.

Plasmidvektorn isoleras från bakteriecellen och vid ett ställe med restriktionsenzym. Klyvningen omvandlar det cirkulära plasmid -DNA: t till en linjär DNA -molekyl.

Nu är de två öppna ändarna av linjär plasmid förenade med ändarna på det främmande DNA som ska sättas in med hjälp av enzym -DNA -ligas. Detta regenererar en cirkulär hybrid eller chimär plasmid, som överförs till en bakterie där den replikerar och förvarar på obestämd tid.

En av de mest använda plasmiderna vid genkloning i bakterier är pBR322, som har både resistensgener för ampicillin och tetracyklin och många restriktionsställen. När ett främmande DNA sätts in i ampicillinresistensgenen av pBR322 kan plasmiden inte längre ge resistens mot ampicillin.


Plasmider av eukaryoter

Författare: Esser, K., Kück, U., Lang-Hinrichs, C., Lemke, P., Osiewacz, H.D., Stahl, U., Tudzynski, P.

Köp den här boken

  • ISBN 978-3-642-82585-9
  • Digitalt vattenstämplat, DRM-fritt
  • Inkluderat format: PDF
  • e-böcker kan användas på alla läsenheter
  • Omedelbar nedladdning av e-bok efter köp
  • ISBN 978-3-540-15798-4
  • Fri frakt för privatpersoner över hela världen
  • Institutionella kunder bör kontakta sin kontoansvarige
  • Vanligtvis redo att skickas inom 3 till 5 arbetsdagar, om det finns i lager

Innehav av plasmider kändes länge endast igen hos bakterierna. Det är nu uppenbart att plasmider, eller replikativa former av DNA, strukturellt och experimentellt jämförbara med bakteriella plasmider, även existerar i eukaryota organismer. Sådana plasmider är faktiskt vanliga bland svampar och högre växter. Den föreliggande översynen görs för att ge en omfattande redogörelse för tillgängliga data om plasmider som finns i eukaryota organismer. Denna recension kommer inte att beakta plasmider av prokaryotiskt ursprung, även om vissa bakteriella plasmider, såsom de tumörinducerande (Ti) plasmiderna av Agrobacterium tumefaciens, kan vara intimt associerade med transformation av den eukaryota värden. Denna bok behandlar dessutom inte transformationsförsök i eukaryota värdar som involverar viralt DNA som vektorer, även om sådana vektorer verkligen har utvecklats för användning i växt- och djursystem. Efter en allmän introduktion, som ger historiskt perspektiv på plasmidernas art och roll, kommer en lista över eukaryota plasmider att presenteras efter deras ursprung. Detta följs av en detaljerad diskussion om känd struktur och funktion. I efterföljande kapitel kommer de praktiska implikationerna av eukaryota plasmider för molekylär kloning och bioteknik att diskuteras. Denna senare del spårar utvecklingen av intresse för bioteknisk genetik och tar särskilt hänsyn till användningen av eukaryota system för genkloning. Terminologi bioteknisk genetik introduceras för läsaren och används i allmän mening som likvärdig med genteknik. Bioteknisk genetik inkluderar, men är inte begränsad till, genkloning genom rekombinant DNA-teknologi.


Ribosomer

Allt cellulärt liv syntetiserar proteiner, och organismer i livets alla tre domäner har ribosomer, strukturer som ansvarar för proteinsyntesen. Ribosomerna i var och en av de tre domänerna är emellertid strukturellt olika. Ribosomer, själva, är konstruerade av proteiner, tillsammans med ribosomalt RNA (rRNA). Prokaryota ribosomer finns i cytoplasman. De kallas 70S ribosoms eftersom de har en storlek på 70S (Figur (PageIndex<7>)), medan eukaryota cytoplasmatiska ribosomer har en storlek på 80S. (S står för Svedberg -enhet, ett mått på sedimentation i en ultracentrifug, som är baserad på storlek, form och ytkvaliteter hos strukturen som analyseras). Även om de har samma storlek har bakteriella och archaeala ribosomer olika proteiner och rRNA -molekyler, och de archaeala versionerna liknar deras eukaryota motsvarigheter än de som finns i bakterier.

Figur (PageIndex<7>): Prokaryota ribosomer (70S) är sammansatta av två subenheter: 30S (liten subenhet) och 50S (stor subenhet), som var och en är sammansatt av protein- och rRNA-komponenter.


Typer av svampceller

De två huvudtyperna av svampceller är jästceller (encelliga svampar) och hyferceller (de individuella cellerna av flercelliga, trådformiga svampar).

Hyphae -celler

Hyfer är grenande, trådliknande strukturer som finns i flercelliga, trådformiga svampar. En enda hyfa består av en lång kedja av rörformiga hyfeceller, som är sammanfogade och delade av inre väggar som kallas septa. Hyfer växer från sina spetsar, vilket gör att filamenten kan spridas och förgrena sig till nya underlag. Hyferna släpper ut matsmältningsenzymer i substratet, som bryter ner det till näringsämnen som svampen kan absorbera.

Hyfer förökar sig asexuellt med hjälp av en process som kallas splittring. Under fragmenteringen kan små bitar av hyfer bryta av och växa till en ny koloni av svampceller.

Jästceller

Jästsvampar är encelliga svampar som förökar sig asexuellt genom gryende. Under denna process delar jästcellskärnan sig med mitos, och en knopp bildas på cellens yta. Så småningom lossnar knoppen för att bli en ny, genetiskt identisk dottercell.

Knoppande producerar pseudohyfer långsträckta, nybildade celler som liknar hyfer. Till skillnad från sanna hyfer är pseudohyphae gjorda av sammanfogade men individuella jästceller som lätt separeras från varandra. Cellerna i sanna hyfer är delar av en flercellig organism och smälts samman av septa.


Bakgrund

Korallrev färgas av fluorescerande proteiner (FP) och kromoproteiner (CP) som utgör en homolog eukaryotisk proteinfamilj med manetergröna FP (GFP) [1, 2]. Dessa GFP-homologer är små proteiner som var och en kodas av en enda gen, omfattar en relativt hög andel lösliga proteiner i uttryckta vävnader och bildar deras kromofor utan att behöva kofaktorer eller substrat andra än syre. Sådana egenskaper underlättade deras kloning och konstruktion för att revolutionera avbildning in vivo. Till skillnad från FP absorberar CP: er intensivt synligt ljus för att ge färger klart synliga under omgivande ljus och har nästan alla låg fluorescens [1, 2].

CP-absorptionsegenskaper ger CP: er vissa fördelar jämfört med FP, såsom instrumentfri detektion med ögon, effektiv FRET-släckning och fotoakustisk avbildning [3, 4]. Detektion av FP kräver en ultraviolett ljus (UV) lampa, fluorometer eller flödescytometer och kan begränsas av bakgrundsfluorescens, fotoblekning och UV-skada på provet. En alternativ populär genetisk reporter, lux-genklustret, kräver en luminometer för detektion. CP-detektering är också fördelaktig jämfört med traditionella kolorimetriska analyser som lacZ, som kräver dyrt exogent tillsatt substrat och kan begränsas av bakgrund från endogent enzym [5]. CP är därför särskilt attraktiva som markörer i levande organismer [6,7,8], för den årliga internationella iGEM -tävlingen och undervisningen [9], som färgbyte, för konst och för cellbiosensortillämpningar inom området där kostnader och låga resurser är viktiga överväganden. Nuvarande metoder för att upptäcka miljö-, jordbruks- och livsmedelsföroreningar, landminor och biostridsmedel samt medicinskt relevanta mål kan förbättras genom syntetisk biologi [10]. Till exempel har bakteriofag konstruerats för att orsaka bioluminescens av patogena bakterier i livsmedel, och bakterier har konstruerats för att fluorescera vid upptäckt av förstörd köttgas [11], trinitrotoluen (TNT) produkter [12] eller arsenik [13]. Anpassning av dessa biosensorer till icke-fluorescerande detektion för användning i stormarknader eller fältet lockar, men det är oklart vilka CP-gener som kan vara lämpliga eller hur man bäst analyserar dem kvantitativt.

Medan GFP-familjen är infödd till eukaryoter, kräver de flesta förutsedda korttidsanvändningarna av CP: er effektivt uttryck i bakterier som t.ex. E coli där ingenjörskonsten är enklare. Sådant effektivt heterologt uttryck kräver ofta kodonoptimering, en mestadels proprietär process som fortfarande är mer av en konst än en vetenskap, vilket kräver validering i varje fall [14]. Vissa CP-gener är tillgängliga kommersiellt, men produkter har avbrutits utan förvarning (t.ex. fwYellow) och de saknar karaktäriseringen och den fria tillgängligheten som är förknippad med publicering. CP: er från ATUM kostar $ 225/gen [15] och innehåller oönskade ("olagliga") restriktionssajter som stör den populära, standardiserade, BioBrick -kloningsmetoden [16], medan våra CP: er görs tillgängliga via registret över biologiska delar [16] deras 500 $ årsavgift. Dessutom, precis som FP-jämförelser behövdes för att bestämma vilka FP:er som var bäst för ingenjörskonst och vissa tillämpningar [17], måste CP:er jämföras och deras egenskaper och analyser förbättras.

CP-publikationer har hittills inte rapporterat om bakteriell celltoxicitet och fokuserar vanligtvis på en individuell CP ([2, 15, 18,19,20,21,22] i tabell 1), vilket gör en undersökning av de relativa egenskaperna hos CP och deras gener svårt. Av de 11 icke-syntetiska CP-gener listade i de högra sju kolumnerna i Tabell 1, uttrycktes alla enbart från deras naturliga eukaryota DNA-sekvenser, med endast fyra som rapporterades vara uttryckta och mogna tillräckligt högt i E coli att ge intensivt färgade kolonier (asPink, amilGFP, aeBlue och amilCP). Därför ansåg vi att, för några av de andra sju naturliga CP-generna, kodonoptimering av de eukaryota sekvenserna för att matcha E coli preferenser kan vara nödvändiga för högt funktionellt uttryck hos bakterier. Här, för att förenkla och utöka CP -studier och applikationer, gör vi tillgängliga 14 konstruerade CP -gener som uttrycks funktionellt, karakteriseras och jämförs i E coli, tillsammans med kromosomala mutanter lämpliga för tävlingsanalyser.


Vad är kromosomalt DNA

Kromosomalt DNA är det genomiska DNA: t. Både eukaryot och det prokaryota genomet är organiserat i kromosomer. Prokaryota genomet innehåller bara en enda kromosom, som är cirkulär. Å andra sidan innehåller det eukaryota genomet flera kromosomer, som är linjära. Varje kromosom innehåller ett replikationsursprung och eukaryota kromosomer innehåller mer än ett replikationsursprung på grund av deras stora storlek. Kromosomalt DNA är alltid dubbelsträngat.

Figur 2: Kromosomalt DNA

Antalet av en viss typ av kromosom i genomet beror på typen av art. De flesta genomerna på jorden är dock diploida och innehåller två kopior av en viss typ av kromosom. Eftersom kromosomalt DNA representerar genomet för en viss organism, är informationen i generna i det kromosomala DNA nödvändig för tillväxt, utveckling och reproduktion av organismen.


Metoder

Databaser

Homologer för HUH -endonukleaserna hämtades genom att söka mot proteinsekvensdatabaser filtrerade till 50 respektive 90% sekvensidentitet (UniRef50 respektive UniRef90) som laddades ner från http://www.uniprot.org. Sök efter bakteriehomologer av CRESS-DNA-virus Reps utfördes mot nr90 (NCBI: s databas (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/) filtrerad till 90% identitet). För att upptäcka likhet med fjärrsekvens använde vi databaser med sekvensprofiler som inkluderade profiler från PDB (www.pdb.org), SCOP 69, Pfam 70 och CDD 71. För frågeprofilgenerering användes nr70 databas.

Sekvenssökningar och klustring

Homologer av HUH-superfamiljens endonukleasdomäner för varje representativ Rep-sekvens erhölls genom att utföra tre jackhmmer 72 iterationer mot UniRef50-databasen. Representativa representanter valdes ut som frågor för homologisökningar baserat på uttömmande granskning av litteratur om HUH -superfamiljen 16,17,28,53. Dessutom, för HUH -grupper med färre än 10 homologer i UniRef50, upprepade vi sökningar mot UniRef90 -databasen. För homologisökningar användes endast HUH -endonukleasdomänen för att undvika att locka till sig icke -relaterade proteiner, till exempel innehållande superfamilj 1 eller 3 helikasdomäner. Kluster utfördes dock med hjälp av sekvenser i full längd för att bättre återspegla deras evolutionära historia. Datauppsättning som erhållits genom sökningar mot UniRef-databaserna kompletterades med CRESS-DNA-virusreparationer utan uppenbara rekombinanta sekvenser från vår tidigare studie 53. Sekvenser grupperades med CLANS med BLAST -alternativ 35. CLANS är en implementering av Fruchterman-Reingold kraftstyrda layoutalgoritmen, som behandlar proteinsekvenser som punktmassor i ett virtuellt flerdimensionellt utrymme, där de lockar eller stöter bort varandra baserat på styrkan i deras parvisa likheter (CLANS sid-värden) 35. Således dras evolutionärt närmare besläktade sekvenser till samma delar av kartan och bildar distinkta kluster. Rep-kluster identifierades med CLANS konvexa algoritm vid P-värde = 1e − 08. För att samla in bakteriella homologer av CRESS-DNA-virusreparationer använde vi representativa sekvenser som frågor och utförde två jackhmmer-iterationer mot nr90-databasen. Den resulterande uppsättningen sekvenser grupperades med hjälp av en konvex klusteralgoritm (kl P-värde = 1e−05) i CLANS. För att säkerställa att vi samlade alla bakteriella homologer konstruerades HMM -profiler för varje identifierat kluster och användes som frågor för sökningar mot nr90 med hmmsearch 72. Tillträden av proteiner för varje grupp, som visas i fig. 1, är tillgängliga för nedladdning (kompletterande data 1). För insamling av SF3 -helikasdata, helikasdomänen för en YLxH -supergruppsmedlem från Streptococcus canis (WP_003048523) användes som en fråga för hmmer -sökning mot nr30 -databasen som är tillgänglig på Bioinformatics Toolkit -servern 73. Den resulterande datamängden kompletterades med SF3-helikasesekvenser från CRESS-DNA-virus 53, polyomavirus, papillomavirus, parvovirus och P. pulchra-liknande plasmider (kompletterande data 1). Extraherade helikasdomäner filtrerades till 70 % identitet med CD-HIT (parameter "-c 0,7") 74 .

Fjärrhomologidetektion

Sekvenssökningar baserade på profil-profiljämförelser användes för att upptäcka fjärrhomologi. För profilgenerering kördes två iterationer av jackhmmer 72 mot nr70-sekvensdatabasen med användning av E-värde = 1e − 03 inkluderingströskel. De resulterande profilerna användes för att söka mot profildatabaser med HHsearch 75. Sökresultat för proteiner från representativa bakteriella plasmider och integrerande element finns tillgängliga i kompletterande data 1.

Flera sekvensjusteringar och fylogenetisk analys

För att konstruera flera sekvensanpassningar för fylogenetisk analys använde vi MAFFT 76 och TrimAl 77. MAFFT-alternativen G-INS-i och L-INS-i och TrimAl-gapströsklarna 0,05 och 0,15 användes för att generera justeringar för Fig. 2 respektive 5. De resulterande anpassningarna täckte både HUH- och SF3-domäner (där tillgängliga) och innehöll 743 respektive 508 positioner. Båda inriktningarna finns i tilläggsdata 2 och 3. Fylogenetiska träd beräknades med PhyML 78 med hjälp av automatiskt modellval och aBayes grenstöd. Substitutionsmodeller VT + G + I + F (VT, aminosyraersättningsmatris G, gammaformparameter: uppskattad (1,864) I, andel oföränderliga platser: uppskattad (0,005) F, jämviktsfrekvenser: empiriskt) och LG + G (LG , aminosyraersättningsmatris G: uppskattade (1,807)) substitutionsmodeller valdes för fylogenetiska analyser som visas i Fig. 2 respektive 5. Ytterligare träd konstruerades med IQ-Tree v1.6.8 (ref. 79) med Ultrafast Bootstrap Approximation branch support 80 och RAxML med icke-parametrisk bootstrapping 81. Blandningsmodellträdet konstruerades med IQ-Tree 79 med användning av modellparametrar (LG + C20 + F + G) och ultrasnabb bootstrap (med 1000 replikat). Alignment and guide tree (parameters “-s” and “-ft”, respectively) were the same as in Fig. 5. Highly diverged sequences forming long branches were removed before constructing final trees. Bacilladnaviridae viruses were also removed, because their position was not stable in trees with different sequence sampling (Supplementary figure 6). Phylogenetic trees are available from the authors upon request. The trees shown in Figs. 2, 5, S5 and S6 can be found in the Supplementary Data 4 to 10.

Statistiska tester

Alternative topologies for the Rep tree were tested using the IQ-Tree software version 1.6.8 with the following parameters: -m LG+G -n 0 -zb 100000 -zw -au (ref. 79 ). As an unconstrained tree, we used the original PhyML tree (Fig. 5), which was tested against each of the constrained trees. The following tests were performed: Approximately Unbiased (AU) test 82 , logL difference from the maximal logl in the set, RELL test 83 , one sided and weighted Kishino–Hasegawa (KH) tests 84 , Shimodaira–Hasegawa (SH) test 85 , weighted SH test, Expected Likelihood Weight (ELW) test 86 .

Sequence logos

Sequence logos for the Reps of CRESS-DNA virus families were taken from ref. 57 . Alignments for other groups were obtained from an alignment used to build the tree shown in Fig. 5. Sequence logos were created using WebLogo server 87 .

Genomic context analysis

The integrated plasmids were identified by thorough analysis of genomic neighborhoods of the Rep-encoding genes. The precise borders of integration were defined based on the presence of direct repeats corresponding to attachment sites. The repeats were searched for using Unipro UGENE 88 . Genes of integrated plasmids were annotated based on the HHsearch searches 75 . Genome maps were compared and visualized using Easyfig with tBLASTx option 89 .

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.


Packaging of DNA, Genome, chromosomal proteins, DNA in Prokaryotes & Eukaryotes

Prokaryotes are living organisms whose genetic material is not surrounded by a nuclear membrane, but found free in the cytoplasm such as bacteria, DNA molecules of mitochondria and chloroplasts (organelles of eukaryotic cells) are very similar to those of prokaryotes, Plasmids are found in the yeast cells (from eukaryotes).

DNA in Prokaryotes

DNA of Escherichia coli bacterium as an example for prokaryotes:

  1. DNA exists as a double helix with its ends joined to each other to form a circle.
  2. If DNA was stretched out in a straight line, it would be about 1.4 millimeters in length, whereas the cell itself is only about 2 micron in length.
  3. DNA is folded many times and occupied a nuclear area about 0.1 of the cell’s volume.
  4. DNA molecule is attached to the plasma membrane at one point or more.

Some bacteria contain one or several additional, much smaller and circular DNA molecules which are called “plasmids”, Plasmids are much smaller circular DNA molecules and not complexed with proteins.

Importance of plasmids: Plasmids are widely used in the field of genetic engineering, where the bacterial cell replicates any plasmid inside it during the replication of its main DNA and the scientists take advantage of this activity by introducing artificial plasmids into the bacterial cells, in order to obtain several copies of them.

Packaging of DNA

DNA in Eukaryotes

Eukaryotes are living organisms whose genetic material is surrounded by a nuclear membrane that separates it from the cytoplasm and DNA is organized into several chromosomes, The human’s somatic cell contains 46 chromosomes, Chromosomes appear in eukaryotic cells during the cell division.

Structure of chromosomes

Each chromosome contains a single DNA molecule, extending from one end of the chromosome to the other end, DNA molecule is coiled and folded many times and associated with various proteins, forming a “chromatin” which contains roughly equal amounts of DNA and proteins.

Chromatin is one molecule of DNA that is coiled and folded many times and associated with proteins, The chromosomal proteins are divided into Histone proteins and Non-histone proteins.

Histone proteins

Histones are a well-defined group of small structural proteins, where they have a high content of the basic amino acids “arginine” and “lysine” and present in great amounts in the chromatin of any cell.

At the normal pH of the cell, the amino acids “arginine” and “lysine” have a positively charged alkyl groups (R), So, they bind strongly to the negatively charged phosphate groups of DNA molecule, Histones proteins are responsible for shortening the DNA molecule tenfold by forming a string of nucleosomes.

Non-histone proteins

Non-histones are heterogeneous groups of structural and regulatory proteins with many functions found in the structure of chromatin and they present in a little amount, Non-histone proteins have many different functions because they contain :

  • Structural proteins enter in the structure of some definite parts of DNA molecule and play the main role in the spatial organization of DNA within the nucleus as they are responsible for shortening DNA about 100,000 times by forming the packed chromatin.
  • Regulatory proteins determine whether the DNA code will be used in making RNA, proteins and enzymes or not.
Packaging of DNA

If we imagine that DNA double helix of each chromosome was lined up and stretched out, it would be about 2 metres in length, The histones and other proteins are responsible for packing this long molecule into the cell’s nucleus that of 2 : 3 micron in diameter.

Steps of DNA packaging

Biochemical analysis and electron micrographs have shown that DNA is packed, as follows:

  1. DNA is wounded around clusters of histones, forming a string of particles that is called “nucleosomes”, this shortens the molecule about tenfold, but it must be packed about 100,000 times more tightly to fit into the nucleus.
  2. The string of nucleosomes is coiled to pack the nucleosomes together, However, even this is not sufficient to shorten the DNA molecule to the required length.
  3. The tightly coiled strings of nucleosomes are arranged in large loops that are held together by the structural non-histone proteins to form the chromatin, Chromatin is packed up as tightly as possible to be condensed into the chromosome.

Nucleosomes are a string of particles that found in the chromosomes and consist of DNA molecule wounded (wrapped) around clusters of histones to shorten the DNA molecule about tenfold.

When DNA is packed as chromatin, replication enzymes apparently can’t reach it, This packaging must be unwounded at least into a string of nucleosomes before DNA can serve as a template for DNA or RNA synthesis.

Structure of the genome

In 1977, researchers found methods that can be used for determining the sequence of nucleotides in DNA and RNA molecules, This provided the tools to describe precisely how genes are arranged within the cell’s DNA molecule, Genome is the total of all genes ( all DNA) found in the cell.

DNA contains genes that carry instructions to construct the :

  • The sequence of nucleotides that is responsible for making proteins.
  • The sequence of nucleotides that transcribes the ribosomal RNA (rRNA) which enters the building of ribosomes.
  • The sequence of nucleotides that transcribes the transfer RNA (tRNA) which carries the amino acids during protein synthesis.

The genes in prokaryotes are the genes that are responsible for the RNA and protein synthesis and represent most of the genome.

The genes in eukaryotes: less than 70% of the genome serve the function of RNA and protein synthesis and the rest of the genome is unaccounted ( has unknown function).

Repetitive DNA

Most genes are present in only one or few copies in the genome, such as:

Genes needed to synthesize the ribosomal RNA and histones that the cell needs in large amounts, where they are reasonable to suppose that having multiple copies of these genes to speed up the cell’s production of new ribosomes and histones, So, there are many -often hundreds- of copies of the genes in all the eukaryotic cells.

Some nucleotides sequences of DNA have been repeated many times, The role of most of this repetitive DNA is still unclear, For instance, in the fruit fly (Drosophila), the brief nucleotides sequence (A-G-A-A-G) is repeated about 100,000 times in the middle of one chromosome, This and many other repeated sequences are noncoding DNA.

Other noncoding DNA

The satellite DNA of some chromosomes is noncoding, Eukaryotic genomes contain a great deal of other noncoding DNA, where the geneticists observe that the amount of DNA in species’ genome bears little relationship to the complexity of the organism or the number of proteins that is produced by it, Little amount of DNA of the plants and animals actually codes for protein synthesis.

Example: The largest known genome belongs to the salamander, its cells contain about 30 times the amount of DNA found in the human cells, although they produce fewer proteins, this is due to the noncoding of a large amount of DNA.

Functions of noncoding DNA:

  1. Perhaps some of the noncoding DNA act on keeping the chromosomes structure.
  2. Some regions of DNA are references to the places at which the messenger RNA (mRNA) synthesis should start and these regions are important in the protein synthesis.

We can compare between prokaryotic DNA and eukaryotic DNA, as follows:

Prokaryotic DNA

It exists as a double helix, its ends are joined together, it is attached to the plasma membrane at one point or more and it is not organized in the form of chromosomes, It is found in the cytoplasm (not surrounded by the nuclear membrane), It is not complexed with proteins.

The most are coding, It starts from the attachment point with the plasma membrane, Plasmids present and not complexed with proteins, Most of them are responsible for making the RNA and proteins.

Eukaryotic DNA

Eukaryotic DNA exists as a double helix, its ends are free and it is organized in several chromosomes, It is found in the nucleus (surrounded by the nuclear membrane), It is complexed with histone and non-histone proteins.

Some are non-coding, It starts at any point along the DNA molecule, Plasmids present in the yeast only, Less than 70% serve the function of RNA and protein synthesis and the rest of the genome is unaccounted (has unknown function).


Titta på videon: What is a Plasmid? - Plasmids 101 (Februari 2023).