Information

Vad är en funktionell skärm?

Vad är en funktionell skärm?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jag gick igenom den här uppsatsen, men förstod inte en term.
Vad är innebörden av funktionell skärm?

(Jag är ingen biologistudent, jag förstår inte mycket, och en liten enkel förklaring skulle räcka)


Från sammanfattningen av den länkade artikeln (Guttman, 2002):

Vi använde en genetisk screening in vivo för att identifiera 13 effektorer [... ]. Även om de delar lite övergripande homologi, hade de aminoterminala regionerna av dessa effektorer slående lika aminosyrasammansättningar.

Och från kroppen:

Screeningen förlitade sig på typ III-sekretionssignalen och den endogena promotorn för humlegenen och var således mycket specifik.

Därför söker och identifierar författarna proteiner med en sekretorisk signal under reglering av en humlepromotor. A funktionell skärm i denna uppsats hänvisar till analys av proteinprover för att detektera förekomsten av proteiner med en viss funktion.


Multiplexa enCas12a-skärmar upptäcker funktionell buffring bland paraloger som annars är maskerade i monogena Cas9 knockout-skärmar

Poolad bibliotek CRISPR/Cas9 knockoutscreening över hundratals cellinjer har identifierat gener vars störningar leder till konditionsdefekter, ett kritiskt steg för att identifiera kandidatmål för cancer. Emellertid är antalet essentiella gener som detekteras från dessa monogena knockout-screeningar lågt jämfört med antalet konstitutivt uttryckta gener i en cell.

Resultat

Genom en systematisk analys av skärmdata i cancercellinjer som genererats av Cancer Dependency Map, observerar vi att hälften av alla konstitutivt uttryckta gener aldrig detekteras i någon CRISPR-skärm och att dessa aldrig väsentliga är mycket berikade för paraloger. Vi undersökte funktionell buffring bland cirka 400 paralogkandidatpar med CRISPR/enCas12a dubbelgen knockout-screening i tre cellinjer. Vi observerar 24 syntetiska dödliga paralogpar som har undkommit upptäckt av monogena knockout-skärmar vid stränga trösklar. Nitton av 24 (79 %) syntetiska dödliga interaktioner finns i minst två av tre cellinjer och 14 av 24 (58 %) finns i alla tre cellinjer som testas, inklusive alternativa subenheter av stabila proteinkomplex samt funktionellt redundanta enzymer.

Slutsatser

Tillsammans antyder dessa observationer starkt att funktionellt redundanta paraloger representerar en målbar uppsättning genetiska beroenden som är systematiskt underrepresenterade bland cellessentiella gener i monogena CRISPR-baserade förlust av funktionsskärmar.


En funktionell skärm identifierar hDRIL1 som en onkogen som räddar RAS-inducerad senescens

Primära fibroblaster svarar på aktiverad H-RAS V12 genom att genomgå för tidig arrestering, vilket liknar replikativ senescens 1 . Denna oåterkalleliga "felsäkra mekanism" kräver s19 ARF , p53 och den Retinoblastom (Rb) familj: vid deras avbrott, RAS V12 -Uttryckande celler misslyckas med att genomgå åldrande och fortsätter att föröka sig 1,2,3,4,5,6,7. På liknande sätt, samuttryck av onkogener som c-MITT C eller E1A räddar RAS V12-inducerad senescens. För att identifiera nya gener som tillåter flykt från RAS V12-inducerad senescens, designade vi en opartisk, retroviral komplementär DNA-biblioteksscreening. Vi rapporterar om identifiering av DRIL1, musens mänskliga ortolog Ljus och Drosophila död ringsignal transkriptionsregulatorer. DRIL1 gör att primära murina fibroblaster inte svarar på RAS V12-inducerad antiproliferativ signalering av p19 ARF/p53/p21 CIP1, såväl som av p16 INK4a. På detta sätt räddar DRIL1 inte bara RAS V12-inducerad senescens utan gör också att dessa fibroblaster blir mycket onkogena. Dessutom förevigar DRIL1 musfibroblaster, i närvaro av höga nivåer av p16 INK4a. Immortalisering av DRIL1, vars produkt binder den pRB-kontrollerade transkriptionsfaktorn E2F1 (ref. 8), är korrelerad med induktion av E2F1-aktivitet. På motsvarande sätt inducerar DRIL1 E2F1-målet Cyclin E1, vars överuttryck är tillräckligt för att utlösa flykt från åldrande. Således stör DRIL1 cellulärt skydd mot RAS V12-inducerad proliferation nedströms p19 ARF/p53-vägen.


Referenser

Hering, H. & Sheng, M. Dendritiska ryggar: struktur, dynamik och reglering. Nature Rev. Neurosci. 2, 880–888 (2001).

Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L. & Svoboda, K. Struktur och funktion av dendritiska ryggraden. Annu. Rev. Physiol. 64, 313–353 (2002).

Matsuzaki, M., Honkura, N., Ellis-Davies, G. C. & Kasai, H. Strukturell grund för långsiktig potentiering i enstaka dendritiska ryggrader. Natur 429, 761–766 (2004).

Nagerl, U. V, Eberhorn, N., Cambridge, S. B. & Bonhoeffer, T. Dubbelriktad aktivitetsberoende morfologisk plasticitet i hippocampala neuroner. Nervcell 44, 759–767 (2004).

Bagni, C. & Greenough, W. T. Från mRNP-handel till ryggradsdysmorfogenes: rötterna till fragilt X-syndrom. Nature Rev. Neurosci. 6, 376–387 (2005).

Okamoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A. & Hayashi, Y. Snabb och ihållande modulering av aktindynamik reglerar postsynaptisk omorganisation som ligger bakom dubbelriktad plasticitet. Naturen Neurosci. 7, 1104–1112 (2004).

Yi, J. J. & Ehlers, M. D. Ubiquitin och proteinomsättning i synapsfunktion. Nervcell 47, 629–632 (2005).

Shi, S.H et al. Snabb ryggradsleverans och omfördelning av AMPA-receptorer efter synaptisk NMDA-receptoraktivering. Vetenskap 284, 1811–1816 (1999).

Zhou, Z. et al. Hjärnspecifik fosforylering av MeCP2 reglerar aktivitetsberoende Bdnf-transkription, dendritisk tillväxt och ryggradsmognad. Nervcell 52, 255–269 (2006).

Bingol, B. & Schuman, E. M. Synaptisk proteinnedbrytning av ubiquitin-proteasomsystemet. Curr. Opin. Neurobiol. 15, 536–541 (2005).

Steward, O. & Schuman, E. M. Proteinsyntes vid synaptiska platser på dendriter. Annu. Rev. Neurosci. 24, 299–325 (2001).

Martin, K. C., Barad, M. & Kandel, E. R. Lokal proteinsyntes och dess roll i synapsspecifik plasticitet. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 587–592 (2000).

Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E. & Job, C. Lokal översättning av klasser av mRNA som är riktade mot neuronala dendriter. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 7080–7085 (2001).

Ostroff, L. E., Fiala, J. C., Allwardt, B. & Harris, K. M. Polyribosomer omfördelas från dendritiska axlar till ryggar med förstorade synapser under LTP i utvecklande råtthipocampusskivor. Nervcell 35, 535–545 (2002).

Wells, D. G., Richter, J. D. & Fallon, J. R. Molekylära mekanismer för aktivitetsreglerad proteinsyntes i det synapto-dendritiska utrymmet. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 132–137 (2000).

Kiebler, M. A. & Bassell, G. J. Neuronala RNA-granuler: flyttare och tillverkare. Nervcell 51, 685–690 (2006).

Krichevsky, A. M. & Kosik, K. S. Neuronala RNA-granuler: en länk mellan RNA-lokalisering och stimuleringsberoende translation. Nervcell 32, 683–696 (2001).

Ashraf, S. I., McLoon, A. L., Sclarsic, S. M. & Kunes, S. Synaptisk proteinsyntes associerad med minne regleras av RISC-vägen i Drosophila. Cell 124, 191–205 (2006).

Schratt, G.M. et al. Ett hjärnspecifikt mikroRNA reglerar utvecklingen av dendritiska ryggraden. Natur 439, 283–289 (2006).

Ambros, V. Funktionerna hos djurs mikroRNA. Natur 431, 350–355 (2004).

Bartel, D. P. MikroRNA: genomik, biogenes, mekanism och funktion. Cell 116, 281–297 (2004).

Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N. & Sonenberg, N. Mekanismer för post-transkriptionell reglering av mikroRNA: finns svaren i sikte? Nature Rev. Genet. 9, 102–114 (2008).

Kosik, K.S. Det neuronala mikroRNA-systemet. Nature Rev. Neurosci. 7, 911–920 (2006).

Miska, E.A. et al. Mikroarrayanalys av mikroRNA-uttryck i den utvecklande däggdjurshjärnan. Genom Biol. 5R68 (2004).

Sempere, L.F. et al. Uttrycksprofilering av mikroRNA från däggdjur avslöjar en undergrupp av hjärnuttryckta mikroRNA med möjliga roller i murin och mänsklig neuronal differentiering. Genom Biol. 5R13 (2004).

Kim, J. et al. Identifiering av många mikroRNA som samrenar med polyribosomer i däggdjursneuroner. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 360–365 (2004).

Yeh, D.C., Duncan, J.A., Yamashita, S. & Michel, T. Depalmitoylering av endotelial kväveoxidsyntas av acylproteintioesteras 1 förstärks av Ca2+-kalmodulin. J. Biol. Chem. 274, 33148–33154 (1999).

Rao, A. & Steward, O. Bevis för att proteinbeståndsdelar i postsynaptiska membranspecialiseringar syntetiseras lokalt: analys av proteiner syntetiserade inom synaptosomer. J. Neurosci. 11, 2881–2895 (1991).

Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y. & Tuschl, T. Sekvensspecifik hämning av mikroRNA- och siRNA-inducerad RNA-tystnad. RNA 10, 544–550 (2004).

Zito, K., Knott, G., Shepherd, G. M., Shenolikar, S. & Svoboda, K. Induktion av ryggradstillväxt och synapsbildning genom reglering av ryggradens aktincytoskelett. Nervcell 44, 321–334 (2004).

Mansfield, J.H. et al. MikroRNA-responsiva "sensor"-transgener avslöjar Hox-liknande och andra utvecklingsreglerade mönster av ryggradsdjurs mikroRNA-uttryck. Nature Genet. 36, 1079–1083 (2004).

Vo, N. et al. Ett cAMP-responselement som binder proteininducerat mikroRNA reglerar neuronal morfogenes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 16426–16431 (2005).

Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M. & Giegerich, R. Snabb och effektiv förutsägelse av mikroRNA/målduplex. RNA 10, 1507–1517 (2004).

Kruger, J. & Rehmsmeier, M. RNAhybrid: mikroRNA-målförutsägelse enkelt, snabbt och flexibelt. Nucleic Acids Res. 34, W451–W454 (2006).

Rodenas-Ruano, A., Perez-Pinzon, M. A., Green, E. J., Henkemeyer, M. & Liebl, D. J. Distinkta roller för ephrinB3 i bildandet och funktionen av hippocampus synapser. Dev. Biol. 292, 34–45 (2006).

Eturnay, R. et al. PHR1, ett integrerat membranprotein från sensoriska celler i innerörat, interagerar direkt med myosin 1c och myosin VIIa. J. Cell Sci. 118, 2891–2899 (2005).

Ozaki, N. et al. cAMP-GEFII är ett direkt mål för cAMP vid reglerad exocytos. Nature Cell Biol. 2, 805–811 (2000).

Husseini Ael, D. et al. Synaptisk styrka regleras av palmitatcykling på PSD-95. Cell 108, 849–863 (2002).

Linder, M. E. & Deschenes, R. J. Palmitoylation: poliskontroll av proteinstabilitet och trafik. Natur Rev. Mol. Cell Biol. 8, 74–84 (2007).

Kang, R. et al. Neural palmitoyl-proteomik avslöjar dynamisk synaptisk palmitoylering. Natur 456, 904–909 (2008).

Bhattacharyya, R. & Wedegaertner, P. B. Ga13 kräver palmitoylering för plasmamembranlokalisering, Rho-beroende signalering och främjande av p115-RhoGEF-membranbindning. J. Biol. Chem. 275, 14992–14999 (2000).

Kye, M.J. et al. Somatodendritiska mikroRNA identifierade genom laserinfångning och multiplex RT-PCR. RNA 13, 1224–1234 (2007).

Lugli, G., Torvik, V. I., Larson, J. & Smalheiser, N. R. Uttryck av mikroRNA och deras prekursorer i synaptiska fraktioner av vuxna mus framhjärna. J. Neurochem. 106, 650–661 (2008).

Bernard, O. Lim kinaser, regulatorer av aktindynamik. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39, 1071–1076 (2007).

Kurose, H. Ga12 och Ga13 som nyckelreglerande mediator vid signaltransduktion. Life Sci. 74, 155–161 (2003).

Tada, T. & Sheng, M. Molekylära mekanismer för dendritisk ryggradsmorfogenes. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 95–101 (2006).

Obernosterer, G., Leuschner, P. J., Alenius, M. & Martinez, J. Post-transkriptionell reglering av mikroRNA-uttryck. RNA 12, 1161–1167 (2006).

Schratt, G. M., Nigh, E. A., Chen, W. G., Hu, L. & Greenberg, M. E. BDNF reglerar translationen av en utvald grupp av mRNA av ett däggdjursmål av rapamycin-fosfatidylinositol 3-kinasberoende väg under neuronal utveckling. J. Neurosci. 24, 9366–9377 (2004).

Paradis, S. et al. En RNAi-baserad metod identifierar molekyler som krävs för utveckling av glutamaterg och GABAergisk synaps. Nervcell 53, 217–232 (2007).

Obernosterer, G., Martinez, J. & Alenius, M. Låst nukleinsyrabaserad på plats detektion av mikroRNA i musvävnadssnitt. Naturprotokoll 2, 1508–1514 (2007).


Abstrakt

De molekylära nätverken som är involverade i regleringen av HIV-replikation, transkription och latens förblir ofullständigt definierade. För att utöka vår förståelse av dessa nätverk utförde vi en opartisk högkapacitets jäst-en-hybridscreening, som identifierade 42 mänskliga transkriptionsfaktorer och 85 totala protein-DNA-interaktioner med HIV-1 och HIV-2 långa terminala upprepningar. Vi undersökte en undergrupp av dessa transkriptionsfaktorer för transkriptionsaktivitet i cellbaserade infektionsmodeller. KLF2 och KLF3 undertryckte HIV-1- och HIV-2-transkription i CD4+ T-celler, medan PLAGL1 aktiverade transkription av HIV-2 genom direkta protein-DNA-interaktioner. Genom att använda beräkningsmodellering med interagerande proteiner, utnyttjade vi resultaten från vår skärm för att identifiera förmodade vägar som definierar inneboende transkriptionsnätverk. Sammantaget använde vi en funktionell skärm med hög genomströmning, beräkningsmodellering och biokemiska analyser för att identifiera och bekräfta flera kandidattranskriptionsfaktorer och biokemiska processer som påverkar HIV-1- och HIV-2-transkription och latens.


Kromatinimmunfällning-baserad skärm för att identifiera funktionella genomiska bindningsställen för sekvensspecifika transaktivatorer

FIKON. 1. Analys av p53-, MDM2- och p21-proteinnivåer i MCF-10A-celler och HMEC efter ADR-behandling. Visad är Western blot-analys av p53-, MDM2- och p21-protein som skördats från MCF-10A och primär HMEC som inte behandlades (-) eller behandlades (+) med ADR (350 nM) under 8 timmar. FIKON. 2. System för val av jäst. De kandidatuppströmsaktiverande sekvenserna (UAS) som utvanns från ChIP klonades in i pBM947-reportervektorn innehållande HIS3-genen under kontroll av en basal GAL1-promotor och en URA1-markör. Det pBM947-baserade biblioteket transformerades till en auxotrofisk His-defekt jäststam innehållande pRS314SN-vektorn, som uttrycker en galaktosinducerbar human vildtyp p53 och en TRP1-markör. Jäst som innehöll båda vektorerna odlades på galaktosinnehållande, histidinbristmedium (SG-Trp-Ura-His) för att analysera förmågan hos p53 att binda till det potentiella UAS i pBM947-vektorn och aktivera transkription av HIS3-genen. Replikplätering av alla kloner på glukosinnehållande, histidinbristmedium (SD-Trp-Ura-His) utfördes för att utesluta falskt positiva kloner. De kloner som växte i närvaro av glukos ansågs vara falskt positiva och endast de kloner som växte på galaktos, och förmodligen på ett p53-beroende sätt, analyserades vidare. En klon innehållande ett fragment av p21-promotorn som omfattar plats 1 anges som ett exempel på ett positivt resultat. FIKON. 3. Analys av p53 in vivo-bindning till konsensusbindningsställen. Tre uppsättningar vardera av MCF-10A-celler, HMEC- och HK-celler behandlades identiskt: en uppsättning behandlades med ADR (350 nM under 5 timmar) och formaldehyd tvärbunden (ADR +, XL +), en annan uppsättning behandlades inte med ADR och var formaldehydtvärbunden (ADR −, XL +), och en slutlig uppsättning behandlades med ADR och inte formaldehydtvärbunden (ADR +, XL −). DNA för PCR härleddes från p53-specifika och cyklin B1-specifika immunutfällningar (IP) och amplifierades med användning av primrar som flankerar p53-svarselementen i gener som kodar för de angivna proteinerna. PCR:er löstes med polyakrylamidgelelektrofores och gelerna färgades med etidiumbromid. De cyklin B1-specifika IP:erna inkluderades för att bedöma eventuella DNA-fragment renade från tvärbundna lysat ospecifikt. Ingång +, genomisk ingång -, vattenkontroll. PCR-resultat med primrar riktade mot den kodande regionen av GAPDH tjänar som en kontroll för ospecifik DNA IP av p53-specifika antikroppar. FIKON. 4. Jämförande analys av p53-bindning till platser i promotorregioner av kända och kandidatmålgener. I de vänstra panelerna bearbetades fyra uppsättningar av HMEC enligt följande: en uppsättning behandlades med ADR (350 nM under 5 timmar), formaldehyd tvärbunden och immunutfälld med en p53-antikropp (fyllda staplar), en annan uppsättning behandlades med ADR, formaldehyd tvärbunden och immunutfälld med en cyklin B1-antikropp (öppna staplar) en tredje uppsättning behandlades med ADR, inte formaldehyd tvärbunden, och immunutfälldes med en p53-antikropp (prickade staplar) och en sista uppsättning var formaldehydtvärbunden men inte behandlat med ADR och sedan immunutfällt med en p53-antikropp (grå staplar). Kvantitativ realtids-PCR utfördes och varje prov normaliserades till samma genomiska DNA som isolerades från celler som var tvärbundna och bearbetade på samma sätt med undantaget att immunoutfällningssteget inte utfördes. De visade bindningsställena är de som återvanns från biblioteksscreeningen (LS), de som tidigare rapporterats i litteraturen (RS) och de som var potentiella bindningsställen som hittats genom genanalys med användning av p53MH-algoritmen (PS). Basparets matchning av bindningsstället till p53-konsensus visas inom parentes. Resultaten, som visas i procent av inmatat DNA, är från minst tre oberoende experiment, där felstaplarna representerar standardavvikelser. De högra panelerna visar scheman över den genomiska strukturen och lokaliseringen av kända och förmodade p53-bindningsställen som analyserats. Stapelns skuggning indikerar artbevarande enligt indikation. Exoner indikeras med ett E följt av exonnumret i antingen en öppen ruta eller en skuggad ruta (som representerar den terminala exonen). Sekvenserna för bindningsställena som finns i de analyserade regionerna visas, och inom parentes anges avstånden för bindningsställena från början av exon 1. FIKON. 5. p53-beroende reglering av representativt kandidatmålgenuttryck. Det isogena paret av HCT116 p53 +/+ och p53 -/− celler behandlades med ADR (350 nM) under 0, 6, 12 och 24 timmar, HIp53-cellerna (p53) och motsvarande vektorkontrollcellinje (Ø) behandlades med ponasteron A (10 μM) i 24 timmar, och HK-cellerna infekterades med ett GFP- eller p53-uttryckande adenovirus i 30 timmar. Totalt RNA från HCT116-celler och mRNA från HIp53- och HK-celler renades och omvänt transkriberades och kvantitativ realtids-PCR utfördes. Proverna normaliserades till GAPDH och resultaten presenteras som förändringar i förhållande till antingen 0-h HCT116 p53 +/+-provet (vänster panel), HIp53-vektorkontrollcellerna behandlade med ponasteron (mittpanelen) eller HK-cellerna infekterade med ett GFP-uttryckande adenovirus (höger panel). Resultaten är medelvärdet för tre oberoende experiment (MCF-10A-celler och HMEC) eller dubbla experiment (HK-celler), med felstaplar som representerar standardavvikelserna. Observera att y axlarna är inställda på 7,0 med undantag för de vänstra och mellersta panelerna för CDKN1A-genen och de vänstra och högra panelerna för EDN-2-genen.

Innehåll

En funktionsspecifikation definierar inte det föreslagna systemets inre funktion, den inkluderar inte specifikationen av hur systemfunktionen kommer att implementeras. Istället fokuserar den på vad olika externa agenter (till exempel personer som använder programmet, kringutrustning eller andra datorer) kan "observera" när de interagerar med systemet.

Ett funktionskrav i en funktionsspecifikation kan ange följande:

När användaren klickar på OK-knappen stängs dialogrutan och fokus återgår till huvudfönstret i det tillstånd det var i innan den här dialogrutan visades.

Ett sådant krav beskriver en interaktion mellan en extern agent (användaren) och mjukvarusystemet. När användaren ger indata till systemet genom att klicka på OK-knappen, svarar programmet (eller bör svara) genom att stänga dialogfönstret som innehåller OK-knappen.

Ändamål Redigera

Det finns många syften med funktionsspecifikationer. Ett av de primära syftena med teamprojekt är att uppnå någon form av teamkonsensus om vad programmet ska uppnå innan man gör den mer tidskrävande ansträngningen att skriva källkod och testfall, följt av en period av felsökning. Vanligtvis uppnås sådan konsensus efter en eller flera granskningar av intressenterna på det aktuella projektet efter att ha förhandlat fram ett kostnadseffektivt sätt att uppnå de krav som programvaran behöver uppfylla.

  1. För att låta utvecklarna veta vad de ska bygga.
  2. För att låta testarna veta vilka tester som ska köras.
  3. För att låta intressenter veta vad de får.

Process Edit

I den beställda industriella mjukvaruutvecklingens livscykel (vattenfallsmodell), beskriver funktionsspecifikationen Vad måste genomföras. Nästa, Systems arkitekturdokument beskriver hur funktionerna kommer att realiseras med hjälp av en vald mjukvarumiljö. I icke industriell, prototypisk systemutveckling skrivs funktionsspecifikationer vanligtvis efter eller som en del av kravanalys.

När teamet är överens om att konsensus om funktionsspecifikationer uppnås, deklareras den funktionella specifikationen vanligtvis "fullständig" eller "avskriven". Efter detta skriver vanligtvis mjukvaruutvecklings- och testteamet källkod och testfall med den funktionella specifikationen som referens. Medan testning utförs jämförs programmets beteende mot det förväntade beteendet enligt definitionen i funktionsspecifikationen.

Metoder Redigera

En populär metod för att skriva ett funktionellt specifikationsdokument involverar att rita eller rendera antingen enkla trådramar eller exakta, grafiskt utformade skärmdumpar av användargränssnittet. Efter att detta är genomfört, och skärmexemplen är godkända av alla intressenter, kan grafiska element numreras och skriftliga instruktioner läggas till för varje nummer på skärmexemplet. Till exempel kan en inloggningsskärm ha användarnamnsfältet märkt '1' och lösenordsfältet märkt '2' och sedan kan varje nummer deklareras skriftligen, för användning av mjukvaruingenjörer och senare för betateständamål för att säkerställa att funktionaliteten är som avsedd. Fördelen med denna metod är att otaliga ytterligare detaljer kan bifogas till skärmexemplen.


Kvitteringar

Vi tackar Hans Teunissen och Elzo de Wit för deras hjälp med 3C-experimentet och alla medlemmar i Agami-laboratoriet för deras tekniska hjälp och diskussioner. Vi är tacksamma mot NKI Genomics Core Facility för djupsekvensering av våra prover.

Finansiering

Detta arbete stöddes av ERC-AdG enhReg (322493 till RA), ERC-ITN RNA TRAIN (607720 till RA), China Scholarship Council (CSC) (till LL), The Human Frontier Science Program LT000640/2013 (till APU) och The Dutch Organization for Research NWO-TOP 91216002 (till RA). RE stöds av den israeliska cancerföreningen (ICA), med generös hjälp av ICA Nederländernas vänner och av Marguerite Stolz Research Fellowship Fund. ZM stöddes delvis av Gad, Nava och Shye Shtacher-gemenskapen. RE är fakultetsstipendiat vid Edmond J. Safra Center for Bioinformatics vid Tel Aviv University.

Tillgänglighet av data och material

RNA-seq-data är tillgängliga från GEO DB-accessionsnummer GSE112458 [50]. GRO-seq-data är tillgängliga från GEO DB-accessionsnummer GSE109290 [51].


Referenser

Anderson, P. & Kedersha, N. RNA-granuler. J. Cell Biol. 172, 803–808 (2006).

Anderson, P. & Kedersha, N. Stressgranulat: Tao av ​​RNA-triage. Trender. Biochem. Sci. 33, 141–150 (2008).

Kedersha, N. & Anderson, P. Däggdjursstressgranuler och bearbetningskroppar. Metoder Enzymol. 431, 61–81 (2007).

Parker, R. & amp Sheth, U.P -kroppar och kontroll av mRNA -translation och nedbrytning. Mol. Cell 25, 635–646 (2007).

Eulalio, A., Behm-Ansmant, I. & Izaurralde, E. P kroppar: vid korsningen av post-transkriptionella vägar. Natur Rev. Mol. Cell Biol. 8, 9–22 (2007).

Kedersha, N. et al. Bevis på att ternära komplex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-defekta preinitieringskomplex är kärnbeståndsdelar i stressgranuler från däggdjur. Mol. Biol. Cell 13, 195–210 (2002).

Kimball, S.R., Horetsky, R.L., Ron, D., Jefferson, L.S. & Harding, H.P. Däggdjursstressgranuler representerar platser för ackumulering av blockerade translationsinitieringskomplex. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C273-C284 (2003).

Kwon, S., Zhang, Y. & Matthias, P. Deacetylaset HDAC6 är en ny kritisk komponent i stressgranuler som är involverade i stressresponsen. Gener Dev. 21, 3381–3394 (2007).

Eulalio, A., Behm-Ansmant, I., Schweizer, D. & Izaurralde, E. P-kroppsbildning är en konsekvens, inte orsaken, till RNA-medierad gentystnad. Mol. Cell. Biol. 27, 3970–3981 (2007).

Sheth, U. & Parker, R. Decapping och sönderfall av budbärar-RNA förekommer i cytoplasmatiska bearbetningskroppar. Vetenskap 300, 805–808 (2003).

Lykke-Andersen, J. & Wagner, E. Rekrytering och aktivering av mRNA-sönderfallsenzymer av två ARE-medierade sönderfallsaktiveringsdomäner i proteinerna TTP och BRF-1. Gener Dev. 19, 351–361 (2005).

Franks, T. M. & Lykke-Andersen, J. TTP och BRF-proteiner bildar kärnor som bearbetar kroppsbildning för att tysta mRNA med AU-rika element. Gener Dev. 21, 719–735 (2007).

Kedersha, N. et al. Stressgranuler och bearbetningskroppar är dynamiskt omtyckta platser för mRNP-ombyggnad. J. Cell Biol. 169, 871–884 (2005).

Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T. & Anderson, P. Metoder Enzymol. (i pressen).

Cougot, N., Babajko, S. & Seraphin, B. Cytoplasmatiska foci är platser för mRNA-sönderfall i mänskliga celler. J. Cell Biol. 165, 31–40 (2004).

Kedersha, N. et al. Dynamisk pendling av TIA-1 åtföljer rekryteringen av mRNA till däggdjursstressgranulat. J. Cell Biol. 151, 1257–1268 (2000).

Hou, J. C. & Pessin, J. E. Ins (endocytos) och outs (exocytos) av GLUT4-handel. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 466–473 (2007).

Love, D. C. & Hanover, J. A. Hexosaminsignaleringsvägen: dechiffrera "O-GlcNAc-koden". Sci. STKE 2005, re13 (2005).

Marshall, S. Rollen för insulin, adipocythormoner och näringsavkännande vägar för att reglera bränslemetabolism och energihomeostas: ett näringsperspektiv på diabetes, fetma och cancer. Sci. STKE 2006, re7 (2006).

Slawson, C., Housley, M. P. & Hart, G. W. O-GlcNAc cykling: hur en enda socker post-translationell modifiering förändrar vårt sätt att tänka på signalnätverk. J. Cell. Biochem. 97, 71–83 (2006).

Zachara, N. E. & Hart, G. W. Cellsignalering, den väsentliga rollen för O-GlcNAc! Biochim. Biophys. Acta 1761, 599–617 (2006).

Zachara, N.E. et al. Dynamisk O-GlcNAc-modifiering av nukleocytoplasmatiska proteiner som svar på stress. Ett överlevnadssvar av däggdjursceller. J. Biol. Chem. 279, 30133–30142 (2004).

Jones, S.P. et al. Kardioskydd genom N-acetylglukosaminkoppling till cellulära proteiner. Omlopp 117, 1172–1182 (2008).

Zachara, N. E. Kardioskyddets söta natur. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 293, H1324–H1326 (2007).

Zachara, N. E. & Hart, G. W. O-GlcNAc en sensor för cellulärt tillstånd: rollen av nukleocytoplasmatisk glykosylering vid modulering av cellulär funktion som svar på näring och stress. Biochim. Biophys. Acta 1673, 13–28 (2004).

Cheung, W. D. & Hart, G. W. AMP-aktiverat proteinkinas och p38 MAPK aktiverar O-GlcNAcylering av neuronala proteiner under glukosbrist. J. Biol. Chem. 283, 13009–13020 (2008).

Taylor, R.P. et al. Glukosbrist stimulerar O-GlcNAc-modifiering av proteiner genom uppreglering av O-kopplat N-acetylglukosaminyltransferas. J. Biol. Chem. 283, 6050–6057 (2008).

Morris, N.J. et al. Sortilin är det huvudsakliga 110 kDa-proteinet i GLUT4-vesiklar från adipocyter. J. Biol. Chem. 273, 3582–3587 (1998).

Nielsen, M.S. et al. Den cytoplasmatiska svansen av sortilin förmedlar Golgi-endosomtransport och binder VHS-domänen av GGA2-sorteringsproteinet. EMBO J. 20, 2180–2190 (2001).

Wells, L. et al. Kartläggning av platser för O-GlcNAc-modifiering med användning av affinitetstaggar för serin- och treonin-posttranslationella modifieringar. Mol. Cellproteomik 1, 791–804 (2002).

Dai, M. S. & Lu, H. Inhibering av MDM2-medierad p53 ubiquitination och nedbrytning av ribosomalt protein L5. J. Biol. Chem. 279, 44475–44482 (2004).

Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J. & Gallouzi, I. E. Hämning av ubiquitin-proteasomsystemet inducerar stressgranulbildning. Mol. Biol. Cell 18, 2603–2618 (2007).

Gilks, N. et al. Stressgranulatmontering medieras av prionliknande aggregering av TIA-1. Mol. Biol. Cell 15, 5383–5398 (2004).

Brengues, M. & Parker, R. Ackumulering av polyadenylerat mRNA, Pab1p, eIF4E och eIF4G med P-kroppar i Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 18, 2592–2602 (2007).

Hoyle, N. P., Castelli, L. M., Campbell, S. G., Holmes, L. E. & Ashe, M. P. Stressberoende omlokalisering av translationellt primerade mRNPs till cytoplasmatiska granuler som är kinetiskt och rumsligt skilda från P-kroppar. J. Cell Biol. 179, 65–74 (2007).

Stoecklin, G., Mayo, T. & Anderson, P. ARE-mRNA-nedbrytning kräver 5′-3′ sönderfallsvägen. EMBO Rep. 7, 72–77 (2006).


En molekyls anatomi: Vad gör remdesivir unikt?

Världshälsoorganisationen sammankallade i slutet av januari experter för att diskutera experimentell terapi för patienter med det framväxande coronaviruset utan namn, utan vaccin och ingen behandling. Panelen rapporterade att &ldquo bland de olika terapeutiska alternativen ansågs remdesivir vara den mest lovande kandidaten.&rdquo

Inom några veckor pågick en klinisk prövning av substansen i Kina. Resultat väntas i april under tiden, utbrottet av SARS-nCoV-2, viruset som orsakar covid-19, har blivit en global pandemi.

Remdesivir är en nukleosidanalog, en av de äldsta klasserna av antivirala läkemedel. Det fungerar genom att blockera RNA-polymeraset som coronavirus och relaterade RNA-virus behöver för att replikera sina genom och föröka sig i värdkroppen.

Molekylen syntetiserades ursprungligen som en del av en screening för inhibitorer av hepatit C-virus RNA-polymeras. Dess uppfinnare vid Gilead Sciences bestämde sig för att gå vidare med en annan nukleosidanalogförening för att behandla hepatit C. Men RNA-beroende RNA-polymeraser bevaras mellan många virus. Experiment in vitro, i cellodling och i djurmodeller har visat att remdesivir har bredspektrumaktivitet mot RNA-virus, inklusive filovirus (som det som orsakar ebola) och coronavirus.

Remdesivir liknar RNA-basen adenosin, som här visas som ett monofosfat.

Sammansättningen och ATP har några viktiga skillnader, men vissa egenskaper är väldigt lika. ASBMB Today pratade med läkemedelskemist Katherine Seley&ndashRadtke vid University of Maryland, Baltimore County, och strukturell virolog Craig Cameron vid University of North Carolina, Chapel Hill om vad som gör molekylen intressant. Klicka på en funktion markerad med blått för att läsa deras kommentarer.

3&rsquo hydroxigrupp

Olika klasser av nukleosid/nukleotidanaloger har olika effekter på polymeraser. Remdesivir är i en klass som kallas icke-obligata kedjeterminatorer, eftersom det i teorin borde vara möjligt att lägga till fler nukleotider till en RNA-sträng efter att remdesivir har tillsatts på grund av närvaron av hydroxylgruppen vid kol 3 i sockret.

"Den hydroxigruppen är vad som krävs för fortsatt syntes av nukleinsyra, oavsett om det är RNA eller DNA," sa virologen Craig Cameron, professor vid University of North Carolina i Chapel Hill som studerar interaktionerna mellan nukleosidanaloger och virala polymeraser.

Ny forskning tyder på att när det blandas med RNA-polymeraser från coronavirus eller flavivirus in vitro, avslutar remdesivir syntesen av en ny RNA-sträng direkt. Istället, sa Cameron, &ldquoDet tar några cykler av nukleotidtillsats innan du kan se avslutningseffekten.&rdquo

Dessa ytterligare nukleotider kan hjälpa till att skydda remdesivir från korrekturläsande enzymer från coronavirus som är kända för att ta bort onaturliga nukleotidanaloger.

Basparning med uracil

I adenosin i dubbelsträngat RNA är denna yta av molekylen involverad i basparning med uracil. De två kväveatomerna fungerar som protondonator respektive acceptor för vätebindningar till atomer i uracilbasen.

Kemister tror att remdesivir, genom att presentera ett mycket liknande bindande ansikte, blir inkorporerat i en växande RNA-sträng av virala polymeraser.

C-nukleosidbindning

Kopplingen mellan ribos och basen kallas glykosidbindningen. Vanligtvis kopplar den 1&rsquo-kolet i ribosringen till ett kväve i basen. Men i remdesivir (och vissa andra nukleotidanaloger) är sockret och nukleobasen förbundna med en bindning mellan två kol.

&ldquoDet ger definitivt mycket större stabilitet (mot) nukleaser och andra enzymer som kan klyva nukleobasen från sockret, säger Katherine Seley-Radtke, en medicinsk kemist vid University of Maryland, Baltimore County som arbetar med design och syntes av antiviral nukleosid analoger. Med en C-nukleosid måste du bryta en kol-kol-bindning, medan du i en normal nukleosid bryta en hemi-aminal bindning, som faktiskt är ganska instabil. Så att ha den kol-kolbindningen är en stor fördel.&rdquo

1&rsquo cyanogrupp

Fråga en grupp kemister vad de tycker om remdesivir, så börjar de flesta med denna dramatiska egenskap. Substitution vid detta kol är ovanligt och förmodligen endast möjligt på grund av styrkan hos C-nukleosidbindningen.

Enligt en artikel i Journal of Medicinal Chemistry tillsattes cyanogruppen initialt eftersom en prekursormolekyl, en mycket effektiv hämmare av virala RNA-polymeraser, också blockerade mitokondriella RNA-polymeraset hos möss. För att göra en molekyl utan dessa giftiga biverkningar, försökte kemister vid Gilead en serie substitutioner vid 1&rsquo-kolet. Föreningen med cyanogruppen fungerade bäst: den blockerade fortfarande hepatit C-polymeraset, men inkorporerades inte längre av värdcellspolymeraser.

&ldquoDu kan&rsquot förutsäga aktivitet. Du måste göra det och testa det, sa Seley-Radtke. &ldquoMen även små förändringar kan få fantastiska konsekvenser.&rdquo

Fosfat

&ldquo Du ser allt flottsam och jetsam komma av vid 5&rsquo hydroxylen?&rdquo sa Katherine Seley-Radtke. Bland medicinska kemister är denna typ av skyddsgrupp slentrianmässigt känd som &ldquoa McGuigan protide.&rdquo Designad av läkemedelskemisten Chris McGuigan på 1990-talet, används denna typ av skyddsgrupp och dess variationer i stor utsträckning för att leverera nukleotidanaloger till celler.

&ldquoDet är ett lysande system, eftersom det åstadkommer två saker,&rdquo Seley-Radtke sa. &ldquoNr. 1, ett problem med nukleosider är att de är polära och deras fosfater är ännu mer polära. Maskering av de mycket negativa fosfatgrupperna med estrar eller amider minskar molekylens totala polaritet och låter den passera plasmamembranet till celler.

För det andra, för att kännas igen av polymeraser, måste analogen likna ett normalt nukleotidtrifosfat, vilket betyder att den måste fosforyleras.

&ldquoThe first phosphorylation, either by cellular or viral kinases, is oftentimes very difficult,&rdquo Seley-Radtke said. &ldquoA lot of those kinases are very, very picky in terms of recognition.&rdquo By arriving in the cell with its first phosphate already in tow, remdesivir and related nucleotide analogs skip that rate-limiting step. After the protecting groups are cleaved, the nucleotide analog is a reasonable substrate for later nucletodie kinases.