Information

Hur bildas catenaner när DNA replikerar?

Hur bildas catenaner när DNA replikerar?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Så jag går en kurs i DNA-replikation och reparation. Och vi pratar om katenaner som bildas när DNA replikerar (två cirklar av dsDNA sammanlänkade) Hur är detta möjligt?


Den första DNA-cirkeln är dubbelsträngad. Om du kunde smälta dubbelhelixen helt skulle du inte kunna dra isär de två stativen utan att bryta sockerfosfatryggraden på åtminstone ett av de två strängarna. Detta är ett topologiskt problem, de två strängarna är kopplade till varandra.

Överväg nu DNA-replikation. I det enklaste exemplet finns det ett enda replikationsursprung och det kommer att finnas två replikationsgafflar som fortsätter runt det cirkulära genomet i motsatta riktningar. Det är precis vad som händer under DNA-replikation i bakterien E coli. DNA-dubbelhelixen hos modermolekylen "smälter", RNA-primrarna syntetiseras av primas och DNA-polymeraskomplexen initierar syntes. Bakom varje replikationsgaffel finns nu två hybrid-DNA-strängar, var och en med en föräldrasträng och en ny dottersträng.

Hittills har inga socker-fosfatbindningar klyvts. När replikeringen är gjord kommer varje dotter-ds DNA-helix att ha ett enkelsträngat hack vid ursprunget, och ett annat vid platsen där replikationen avslutades, men dessa kommer snabbt att repareras av DNA-polymeras I och DNA-ligas. Även om dessa två reparationsenzymer skulle hämmas, och du på något sätt skulle kunna smälta DNA-strängarna från båda dotterkromosomerna, skulle du bara kunna dra ut de nya DNA-molekylerna (med skårorna), de två ursprungliga föräldrasträngarna är fortfarande topologiskt kopplade.

För att lösa två sammanlänkade DNA-cirklar måste du göra en dubbelsträngad brytning i minst en av ds-cirklarna. Denna enzymatiska aktivitet tillhandahålls av en klass av enzymer som kallas typ II DNA-topoisomeraser.


Topologiska utmaningar för DNA-replikation: konformationer vid gaffeln

Avvecklingen av parental DNA-duplex under replikering orsakar en positiv länknummerskillnad, eller superhelisk stam, att byggas upp runt den förlängda replikationsgaffeln. Förgreningen vid gaffeln och denna stam ger upphov till andra konformationer än den hos (−) supercoiled DNA som inte replikeras. Det replikerande DNA:t kan bilda (+) precatenaner, i vilka dotter-DNA:n är sammanflätade, och (+) supercoils. Topoisomeraser har den väsentliga rollen att lindra den superheliska stammen genom att ta bort dessa strukturer. Avstängda replikationsgafflar av molekyler med en (+) superhelisk stam har ytterligare möjlighet att regrediera, vilket bildar en fyrvägsövergång vid replikationsgaffeln. Denna fyrvägsövergång kan påverkas av rekombinationsenzymer för att starta om replikationen. Replikation och kromosomveckning underlättas av topologiska domänbarriärer, som binder substraten för topoisomeraser i definierade och koncentrerade regioner. Domänbarriärer tillåter också att replikerat DNA (−) supercoilas. Vi diskuterar vikten av att replikera DNA-konformationer och topoisomerasernas roller, med fokus på det senaste arbetet från vårt laboratorium.

En grundlig förståelse av DNA-replikation och rekombination kräver kunskap om konformationerna och topologin för replikerande DNA. Dessa skiljer sig från de för icke-replikerande DNA. Verkan av DNA-helikaser, avbrott i replikerade strängar och, viktigast av allt, den unikt grenade strukturen hos själva replikationsgaffeln bidrar alla till dessa skillnader. I den här recensionen illustrerar vi de stora konformationsskillnaderna mellan replikerande och icke-replikerande DNA och deras fysiologiska betydelse. Vi lyfter fram bevisen för varje struktur in vitro och in vivo. Dessutom tar vi upp hur länkarna som ursprungligen finns i den dubbla helixen i föräldraduplexen löses helt upp i bakterier av två typ-2 topoisomeraser, DNA-gyras och topoisomeras (topo) IV, för att bilda två separata dottermolekyler. Även om vi betonar situationen i bakterier, kommer vi också att göra generaliseringar tillämpliga på eukaryan och archaea.

Vi börjar med att definiera några grundläggande termer som bildar DNA-topologins språk (1). Topologin vi kommer att fokusera på är länkarna mellan de komplementära Watson- och Crick-strängarna i en intakt, topologiskt begränsad del av DNA. Det enklaste exemplet är ett slutet cirkulärt DNA, som finns i plasmider och virus, men resultaten kan generaliseras till linjära kromosomer på grund av deras organisation i slutna domäner eller loopar. Sammanflätningen av de komplementära strängarna beskrivs av länknumret (Lk), vilket är hälften av det förtecknade antalet gånger en sträng korsar den andra i någon projektion. Enligt teckenkonventionen är korsningarna i vanlig B-typ DNA (+). Korsningarna, eller noderna, av de komplementära strängarna kan vara resultatet av den lokala sammanflätningen av själva dubbelhelixen, i vilket fall de mäts med en parameter som kallas twist (Tw). Alternativt resulterar noder från att ett segment av dubbelspiralen korsar ett annat, mätt med vridning (Wr). Lk är summan av Tw och Wr. Noterbart är att Lk är oförändrad av alla deformationer som inte går sönder DNA-brott och återförening. Viktigare är kvantiteten ΔLk, skillnaden mellan Lk och Lk0, där Lk0 är Lk för en avslappnad DNA-molekyl. Påfrestningen på DNA:t från en ΔLk som inte är noll får ofta DNA:t att slingra sig, en form av vridning. Supercoiling kan vara antingen pektonemisk (sammanlindad) eller solenoidal, som när DNA lindas runt ett protein. Det mest användbara måttet på den topologiska avvikelsen för DNA från det avslappnade tillståndet är dess superlindningsdensitet, eller σ. Sigma är lika med ΔLk/Lk0 och är därför oberoende av DNA-längden. Replikation orsakar en ökning av ΔLk, eftersom separation av föräldrasträngarna sänker värdet på Lk0. Därför ökar replikationens ΔLk med ungefär ett för varje tio baspar av replikerat DNA.

Denna recension är uppdelad i tre delar. Vi börjar med att diskutera konformationerna av (−) supercoiled DNA som inte replikerar, den form som DNA antar bort från gaffeln. Därefter diskuterar vi de tre sätten på vilka replikerande DNA kan skilja sig från icke-replikerande DNA: precatenaner, (+) supercoiled DNA och fyrvägsövergången vid fastnade gafflar. Slutligen kommer vi att diskutera topologiska domänbarriärer, som kan binda replikerande DNA-strukturer i begränsade regioner av kromosomen där de kan bearbetas lättare, vilket gör att replikering och kromosomsegregation kan fortsätta.


DNA-replikation: eukaryot förlängning och terminering.

Vi diskuterade om initieringen i de eukaryota cellerna i förra inlägget. I det här inlägget, låt oss titta närmare på Förlängning och den Uppsägning i eukaryot DNA-replikation.

Under initieringen binder och lindar en repertoar av proteiner DNA:t vid ursprung. Till detta proteinkomplex polymerass är laddade. Polymeraserna arbetar tillsammans med andra proteiner för förlängning av dottertrådarna.

(Bara för info: Läs mer om det eukaryota ursprunget i artikeln med titeln ‘Making Sense of Eukaryotic DNA Replication Origins‘.)

Förlängning:

Det första polymeraset som initierar DNA-syntesen är DNA-polymeras a, som finns i form av DNA-polymeras a-primaskomplex. Primas underenheten syntetiserar RNA-primrar (cirka 7-12 nukleotider) som sedan överförs till polymerasdomän och förlängd med DNA-baser (cirka 20-25 nukleotider). Replikationsfaktor C (RFC) initierar en reaktion som kallas polymerasbyte. DNA-strängarna förlängs sedan med andra polymeraser, nämligen DNA-polymeras 5 och DNA-polymeras e.

Syntes av ledande strängar:

Fig 1: Syntes av ledande eller kontinuerlig sträng.

När DNA pol α fullbordar syntetisering av RNA-primer och adderar DNA-baser, RFC orsakar dissociation av DNA pol α och assembler prolifererande cellkärnantigen (PCNA) i regionen av primerterminalen. PCNA är en DNA -klämma för DNA-polymeraser.

Pol ε har rapporterats som det huvudsakliga ledande strängsyntespolymeraset (i Saccharomyces cerevisiae). I den ledande strängen är replikationen kontinuerlig och primern syntetiseras endast en gång och förlängningen utförs (fig 1).

Syntes av eftersläpande strängar:

Fig 2: Syntes av eftersläpande eller diskontinuerlig sträng med serier av Okazaki-fragment.

Polymeraser 5 är huvudpolymeraset vid syntes av eftersläpande strängar. Replikationen i de eftersläpande strängarna är diskontinuerlig och sker med bildning av flera Okazaki fragment (fig 2).

Okazaki-fragment (fig 3) som genereras i eukaryoter under eftersläpande strängsyntes är cirka 200 baser (prokaryoter, cirka 2000 baser) långa. Eftersom flera Okazaki-fragment tillverkas, Polymerasväxling under syntes av Okazaki-fragment är av större betydelse.

Därför består ett Okazaki-fragment av RNA-nukleotider (7-10 nukleotider), sedan tillsätts cirka 10-20 nukleotider av DNA-baser av DNA pol a. Efter vilket RFC orsakar polymerasbyte och deoxiribonukleotiderna tillsätts av DNA pol 5 innehas av PCNA, glidningen klämma (se bilden nedan). DNA pol δ dissocierar efter syntesen av hela DNA-sträckan när den närmar sig den tidigare RNA-primern.

(Bara för info: Lär dig mer om PCNA)

Proteinerna som är involverade i replikeringen, särskilt PCNA (Boehm et al., 2016).

RNA-primrar avlägsnas av RNase H1, så att en ribonukleotid fortfarande är fäst vid DNA-delen (3′-änden) av Okazaki-fragmentet. Denna utelämnade ribonukleotid avlägsnas sedan av flik endonukleas 1 (KÄRR 1). Polymeras 5 fyller sedan luckorna som bildas mellan Okazaki-fragmenten efter att primern avlägsnats. De nick bildas mellan Okazaki-fragmentet och den eftersläpande strängen fylls i av DNA-ligas Ibildar således en enda eftersläpande sträng.

Fig 4: Avlägsnande av RNA-primer och länkning av individuella Okazaki-fragment.

Nukleosomsammansättning:

Under förlängning sker en kontinuerlig demontering som återmontering av nukleosomförpackningen längs DNA också. Som vi vet är en av egenskaperna hos det eukaryota DNA:t att det är förpackat i form av mycket kompakta strukturer som kallas Kromosomer. Det innebär lindning av negativt laddat DNA runt de grundläggande proteiner som kallas histoner att bilda strukturer som kallas nukleosomer (fig nedan). Varje nukleosom består av 8 histon proteiner, två vardera av H2A, H2B, H3 och H4. Histone H1 bildar länk mellan två nukleosomer.

Nukleosomerna.

Under replikering blir två nukleosomer framför replikationsgaffeln, det vill säga orreplikerad DNA, destabiliserats. Därför får replikationsgaffelns rörelse att DNA-förpackningar desorganiseras för att tillåta replikationsproteinerna att interagera med DNA:t.

I den replikerad delvar de ledande och eftersläpande strängarna nukleosomfria till cirka 225 bp respektive 285 bp. Efter denna region packades DNA:t med histonoktomer men en del saknade histon H1. Efter cirka 450 bp till 650 bp från replikationsgaffeln detekterades kompletta nukleosomer med H1 i dottersträngarna. Därför finns det stegvis montering av dottersträngar till fullständig nukleosom.

Föräldrarnas nukleosomer disassocierar och binder slumpmässigt dotter-DNA-strängarna, så att varje sträng har halv av föräldrarnas nukleosomer. De återstående nukleosomkomponenterna som krävs för att packa de två dottersträngarna syntetiseras de novo och monterade på dottersträngarna.

Uppsägning:

Efter den framgångsrika förlängningen måste replikationen avslutas för att ge två separata kopior av DNA:t.

Involverar två intilliggande replikeringsgafflar:

Eftersom den eukaryota cellen har ett stort antal ursprung, innebär avslutningen sammanslagning av två intilliggande replikeringsgafflar. Detta inkluderar fyra olika steg:

– Upplösning:

DNA-sträckan mellan de två intilliggande gafflarna (fig 5.a) är avlindade (fig 5.b) och närmandet CMGs passera varandra (fig 5.c). Det sista Okazaki-fragmentet bearbetas av DNA pol δ och FEN1 (fig 5.d).

De luckor i dottersträngarna (som i normala Okazaki-fragment) fylls i och två motsatt närliggande syntetiserade strängar ligeras.

– Dissociation av replisom:

Det replika komplexet demonterar efter konvergensen av de två replikationsgaffeln. Denna process involverar termineringsspecifik polyubiquitylering av Mcm7 och p97/VCP/Cdc48 segregase (fig 5.e).

– Dekatenering:

Om det finns några sammanflätningar i dotterns DNA-strängar eller katenaner, tas de bort med hjälp av topoisomeras II separera de två delarna.

Fig 5: Uppsägning innebär sammanslagning av de två intilliggande gafflarna (Dewar & Walter, 2017).

Involverar ändarna av kromosomerna:

Som bekant är DNA i eukaryota kromosomer en linjär molekyl, avslutningen i eukaryot DNA inbegriper också fullbordande av replikering vid slutar av kromosomer som kallas Telomerer (fig 6).

Fig 6: Telomerer bildar skyddsänden av eukaryot linjärt DNA (Aulinas, 2013).

Under syntesen av Okazaki-fragment, RNA-primer förse 3′-OH grupp för 5′ till 3′ replikering. Vid avlägsnande av RNA-primer, från släpande sträng vid kromosomänden, slutet återstår oreplicerad och den nyligen syntetiserade strängen är förkortas (fig 7).

Fig 7: Förkortning av kromosomändarna.

Denna förkortning av kromosomen förhindras av närvaron av speciella upprepningar av sekvenser som kallas telomerer (och telomerassocierade proteiner) i ändarna av DNA i kromosomerna innehåller. För t.ex. mänskliga kromosomer skyddas av telomerer som har upprepade sekvenser av (TTAGGG)n på cirka 15–20 kb vid födseln. Dessa strukturer skyddar ändarna på kromosomerna från att felaktigt betraktas som Dubbelsträng av DNA går sönder (DSB).

I normala fall somatiska celler, den telomera regionen av eukaryota kromosomer är förkortas med varje omgång av DNA-replikation. Efter ett visst antal DNA-replikationer, och därmed celldelningar, förkortas telomererna till en sådan grad att det leder till replikativa celler begynnande ålderdom eller apoptos.

(Bara för info: Läs om Nobelpriset till ett verk om telomerer.)

Dock i könslinje och cancerceller, ett enzym som kallas telomeras, förlänger ändarna av kromosomerna, speciellt 5′-änden av de eftersläpande strängarna. Förmågan att behålla längden på telomererna, gör dessa celler odödlig.

Telomeras är en Omvänt transkriptas som har en RNA mall, känd som mallkodande RNA-molekyl (TER30 för förlängning av det telomera DNA:t (fig 8). Det grundläggande protein komponent i telomeras är känd som TERT (TElomeras omvänt transkriptas).

Hos människor har RNA-mallen sekvensen AUCCCAAUC. Den nysyntetiserade upprepningar av telomert DNA läggs till överhänget enkelsträngad 3′-ände av DNA:t (fig 8).

Fig 8: Syntes av telomert DNA-upprepningar med telomeras (Verhoeven et al, 2014).

(Bara för info: besök för att se animationen om action av Telomerase och mycket mer.)

Efter att strängförlängningen på 3′-änden av telomeraset är avslutad, fullbordar DNA pol α och DNA-ligas DNA-strängsyntesen.

Detta är allt för detta inlägg. Hoppas du gillar det här inlägget, om ja kommentera, gilla och dela!!

Följ oss också på Facebook, Twitter, Instagram eller maila oss ([email protected]).

Läs fler inlägg av The Biotech Notes:

Bambara et al. (1997) Enzymer och reaktioner vid den eukaryota DNA-replikationsgaffeln. J Biol Chem. 272(8):4647-50.

Abmayr och Workman (2012) Hålla fast genom DNA-replikering: Histonmodifiering eller modifierare? Cell. 150(5):875-7.

Verhoeven et al (2014). Cellulärt åldrande vid depression: Permanent avtryck eller reversibel process?: En översikt över aktuella bevis, mekanistiska vägar och mål för interventioner. BioEssays 36(10):968-78.

Bailey et al (2015) Uppsägning av DNA-replikationsgafflar: "Att bryta upp är svårt att göra". Nucleus 6 (3):187-196.

Dewar & Walter (2017) Mechanisms of DNA repplication termination. Naturrecensioner Molecular Cell Biology 18:507–516.

Aulinas (2013) Telomerer, åldrande och Cushings syndrom: Är de relaterade? Endocrinology and Nutrition (engelska upplagan) 60(6): 329-335.

Boehm et al. (2016) De många rollerna för PCNA i eukaryot DNA-replikation. Enzymes 39:231-54.


DNA-syntes

Mekanismen för DNA-replikation påverkas i hög grad av DNA-strukturen. Den komplementära basparningen mellan kvävebaserna A-T och G-C ligger till grund för DNA-replikationens semi-konservativa natur, vilket resulterar i ett duplicerat genom med en parental sträng och en nysyntetiserad sträng. Varje sträng fungerar som en mall för DNA-polymeraset för att katalysera tillägget av den korrekta basen under syntes av en ny komplementär sträng. Eftersom strängarna är antiparallella med motsatt polaritet och eftersom DNA-polymeraser endast kan syntetisera DNA i riktningen 5&prime till 3&prime, syntetiseras endast en sträng kontinuerligt. Denna sträng kallas den ledande strängen. Syntes av den andra strängen, kallad lagging-strängen, möjliggörs genom diskontinuerlig syntes av korta fragment, kallade Okazaki-fragment, i riktningen 5&prime till 3&prime, som senare sammanfogas.

Det replikerande DNA:t DNA-replikationsproteiner vid replikationsgaffeln. Helikasen lindar upp duplex-DNA och Single Strand Binding Proteins (SSB) beläggningen och stabiliserar enkelsträngat DNA som bildas genom strängseparation. Topoisomeras ses framför gaffeln och tar bort superhelical spänning orsakad av strängseparation. Observera att den ledande strängen syntetiseras kontinuerligt i riktningen 5&prime till 3&prime, medan den eftersläpande strängen syntetiseras diskontinuerligt som korta fragment som kallas Okazaki-fragment. Polymeras &alfa-primaskomplexet syntetiserar korta RNA-primrar som förlängs upp till 30-40 nukleotider. Därefter tar polymeras &epsilon och polymeras &delta upp jobbet med snabbare och effektivare strängsyntes på eftersläpande respektive ledande strängar. Ligase tätar gapet mellan Okazaki-fragmenten.

DNA-syntes börjar i S-fas när det replikativa helikaset lindas upp och separerar de två strängarna i DNA-dubbelhelixen [7] . När helikaset lindar upp DNA, syntetiserar DNA-polymeras DNA med användning av det exponerade enkelsträngade DNA:t som mall. DNA-polymeraser &lsquoread’rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo;rsquo; Energi för polymerisation kommer från frisättning av ett pyrofosfat från ett fritt deoxiribonukleotidtrifosfat (dNTP), vilket skapar ett 5&primemonofosfat som kan vara kovalent kopplat till 3&prime hydroxylgruppen i en annan nukleotid. DNA-polymeraser kan dock inte syntetisera DNA de novo och kräver en redan existerande primer med en fri hydroxylgrupp för att lägga till nukleotider och förlänga kedjan. Ett specialiserat RNA-polymeras som kallas primas syntetiserar korta RNA-sekvenser cirka 10 nukleotider långa som fungerar som primrar. En enda primer underlättar DNA-replikation på den ledande strängen och flera primers initierar okazaki-fragmentsyntes på den eftersläpande strängen. Hos eukaryoter är primaset en del av DNA-polymeraset &alfa (recensat i [8] ). Den replikativa helikasen och primasen samarbetar funktionellt och stimulerar varandras aktivitet [9].

Efter att DNA-polymeras &alfa har syntetiserat en kort DNA-sträcka på 30-40 nukleotider, överlämnas ytterligare DNA-syntes till polymeras &epsilon och polymeras &delta som har en högre processivitet än polymeras &alfa. Den högre processiviteten eller förmågan hos polymeraserna att förbli associerade med DNA i upp till 10 kb utan att falla av beror på deras association med en glidklämma som kallas PCNA. Polymerasbytet möjliggör DNA-syntes med hög tillförlitlighet eftersom polymeras &epsilon och polymeras &delta har en 3&prime &ndash 5&prime exonukleasaktivitet som möjliggör korrekturläsning och avlägsnande av eventuella felaktiga baser som är inkorporerade (granskas i [8]). Vid replikationsgaffeln finns en arbetsfördelning mellan polymeraserna där polymeras &epsilon utför ledande strängsyntes och polymeras &delta är involverat i syntesen av den eftersläpande strängen [10], 12)


Biologer upptäcker en utlösande faktor för cellextrudering – process för att eliminera onödiga celler

För alla djur är eliminering av vissa celler en nödvändig del av embryonal utveckling. Levande celler slängs också naturligt av i mogna vävnader, till exempel vänder slemhinnan i tarmen med några dagars mellanrum.

Ett sätt som organismer blir av med onödiga celler är genom en process som kallas extrudering, som gör att celler kan pressas ut ur ett lager av vävnad utan att störa lagret av celler som lämnas kvar. MIT-biologer har nu upptäckt att denna process utlöses när celler inte kan replikera sitt DNA under celldelning.

Forskarna upptäckte denna mekanism i masken C. elegans, och de visade att samma process kan drivas av däggdjursceller som de tror att extrudering kan fungera som ett sätt för kroppen att eliminera cancerceller eller precancerösa celler.

"Cellextrudering är en mekanism för celleliminering som används av så olika organismer som svampar, insekter och människor", säger H. Robert Horvitz, David H. Koch professor i biologi vid MIT, medlem av McGovern Institute for Brain Research och Koch Institute for Integrative Cancer Research, en utredare från Howard Hughes Medical Institute och studiens seniorförfattare. "Upptäckten att extrudering drivs av ett misslyckande i DNA-replikation var oväntat och erbjuder ett nytt sätt att tänka på och möjligen ingripa i vissa sjukdomar, särskilt cancer."

MIT postdoc Vivek Dwivedi är huvudförfattare till tidningen, som publicerades den 5 maj 2021, i Natur. Andra författare till artikeln är King's College London forskare Carlos Pardo-Pastor, MIT forskningsspecialist Rita Droste, MIT postdoc Ji Na Kong, MIT doktorand Nolan Tucker, Novartis forskare och tidigare MIT postdoc Daniel Denning, och King's College London professor i biologi Jody Rosenblatt.

Fastnat i cellcykeln

På 1980-talet var Horvitz en av de första forskarna som analyserade en typ av programmerat cellsjälvmord som kallas apoptos, som organismer använder för att eliminera celler som inte längre behövs. Han gjorde sina upptäckter med hjälp av C. elegans, en liten nematod som innehåller exakt 959 celler. Varje cells utvecklingslinje är känd, och embryonal utveckling följer samma mönster varje gång. Under hela denna utvecklingsprocess genereras 1 090 celler och 131 celler genomgår programmerat cellsjälvmord genom apoptos.

Horvitz labb visade senare att om maskarna var genetiskt muterade så att de inte kunde eliminera celler genom apoptos, skulle ett fåtal av dessa 131 celler istället elimineras genom cellextrudering, vilket verkar kunna fungera som en backupmekanism för apoptos. Hur denna extruderingsprocess utlöses förblev dock ett mysterium.

För att reda ut detta mysterium utförde Dwivedi en storskalig skärm med mer än 11 ​​000 C. elegans gener. En efter en slog han och hans kollegor ner uttrycket av varje gen i maskar som inte kunde utföra apoptos. Denna skärm gjorde det möjligt för dem att identifiera gener som är avgörande för att aktivera cellextrudering under utveckling.

Till forskarnas förvåning var många av generna som dök upp som nödvändiga för extrudering involverade i celldelningscykeln. Dessa gener var främst aktiva under de första stegen av cellcykeln, vilket innebär att initiera celldelningscykeln och kopiera cellens DNA.

Ytterligare experiment avslöjade att celler som så småningom extruderas initialt går in i cellcykeln och börjar replikera sitt DNA. De verkar dock fastna i denna fas, vilket leder till att de extruderas.

De flesta celler som till slut blir extruderade är ovanligt små och produceras från en ojämn celldelning som resulterar i en stor dottercell och en mycket mindre. Forskarna visade att om de störde generna som styr denna process, så att de två dottercellerna var närmare samma storlek, kunde de celler som normalt skulle ha extruderats framgångsrikt slutföra cellcykeln och extruderades inte.

Forskarna visade också att de mycket små cellernas misslyckande att slutföra cellcykeln beror på brist på proteiner och DNA-byggstenar som behövs för att kopiera DNA. Bland andra nyckelproteiner har cellerna sannolikt inte tillräckligt med ett enzym som kallas LRR-1, vilket är avgörande för DNA-replikation. När DNA-replikationen stannar stoppar proteiner som är ansvariga för att upptäcka replikationsstress snabbt celldelningen genom att inaktivera ett protein som kallas CDK1. CDK1 kontrollerar också cellvidhäftning, så forskarna antar att när CDK1 stängs av, förlorar celler sin klibbighet och lossnar, vilket leder till extrudering.

Cancerskydd

Horvitz labb slog sig sedan ihop med forskare vid King's College London, ledd av Rosenblatt, för att undersöka om samma mekanism kan användas av däggdjursceller. Hos däggdjur spelar cellextrudering en viktig roll för att ersätta slemhinnan i tarmarna, lungorna och andra organ.

Forskarna använde en kemikalie som heter hydroxyurea för att inducera DNA-replikationsstress i hundnjurceller som odlats i cellkultur. Behandlingen fyrdubblade extruderingshastigheten och forskarna fann att de extruderade cellerna tog sig in i fasen av cellcykeln där DNA replikeras innan de extruderas. De visade också att i däggdjursceller är den välkända cancersuppressorn p53 involverad i att initiera extrudering av celler som upplever replikationsstress.

Det tyder på att utöver sina andra cancerskyddande roller kan p53 hjälpa till att eliminera cancerceller eller precancerösa celler genom att tvinga dem att extrudera, säger Dwivedi.

"Replikationsstress är en av de karakteristiska egenskaperna hos celler som är precancerösa eller cancerösa. Och vad detta fynd antyder är att extruderingen av celler som upplever replikationsstress potentiellt är en tumörsuppressormekanism, säger han.

Det faktum att cellextrudering ses hos så många djur, från svampar till däggdjur, fick forskarna att anta att det kan ha utvecklats som en mycket tidig form av celleliminering som senare ersattes av programmerat cellsjälvmord som involverade apoptos.

"Denna cellelimineringsmekanism beror bara på cellcykeln," säger Dwivedi. "Det kräver inget specialiserat maskineri som det som behövs för apoptos för att eliminera dessa celler, så vad vi har föreslagit är att detta kan vara en ursprunglig form av celleliminering. Detta betyder att det kan ha varit ett av de första sätten att eliminera celler som kom till, eftersom det beror på samma process som en organism använder för att generera många fler celler."

Referens: “Replikationsstress främjar celleliminering genom extrudering” av Vivek K. Dwivedi, Carlos Pardo-Pastor, Rita Droste, Ji Na Kong, Nolan Tucker, Daniel P. Denning, Jody Rosenblatt och H. Robert Horvitz, 5 maj 2021 , Natur.
DOI: 10.1038/s41586-021-03526-y

Dwivedi, som tog sin doktorsexamen vid MIT, var en Khorana-forskare innan han började på MIT för forskarskola. Denna forskning stöddes av Howard Hughes Medical Institute och National Institutes of Health.


Hur lagrar DNA genetisk information?

DNA, även känd som deoxiribonukleinsyra, är livets plan, vilket betyder att den lagrar all information som utgör en levande organism. Men hur lagrar DNA genetisk information?

James Watson och Francis Crick upptäckte strukturen hos DNA – två (polynukleotid) strängar sammanflätade i en dubbelspiral – år 1953. De fann att DNA lagrar information med hjälp av en enkel kod på fyra bokstäver, som involverar en cool funktion som kallas komplementär bas parning.

Så hur fungerar komplementär basparning?

Vi har alla lärt oss att DNA har två strängar tvinnade runt varandra för att bilda dubbelhelix, som skulle likna en stege om vi plattar ut den.

I DNA är varje steg i stegen gjord av två delar, och dessa två delar kallas baser. DNA har fyra namngivna baser - adenin, cytosin, guanin och tymin. De förkortas helt enkelt med deras första initialer, det vill säga – A, C, G och T – och dessa bokstäver representerar den kod som DNA använder för att lagra genetisk information.

En viktig del av Watsons och Cricks upptäckt var sättet på vilket dessa baser parar sig med varandra. De fann att A endast parar med T, och C endast med G. Det vill säga – A och T kompletterar varandra och C i G kompletterar varandra. Detta betyder också att C och G inte kan paras ihop med A eller T.

Till exempel, om en DNA-sträng har baser CTGAC, kommer den andra att ha GACTG. Ett sätt att komma ihåg vilket baspar med vilket är att skriva bokstäverna i alfabetisk ordning, sedan under det – skriv bokstäverna i omvänd ordning.

Men vad betyder allt detta för en cell?

När en cell förbereder sig för celldelning, gör den en kopia av sitt DNA så att de två resulterande dottercellerna har exakt samma genetiska information, eller DNA, som modercellen. Så komplementär basparning innebär att celler kan replikera sitt DNA snabbt och effektivt.

Under replikeringsprocessen separeras den dubbla helixen i mitten där paren av baser förenas. Detta exponerar sekvenserna av A’s C’s G:s och T’s på varje sida. Sedan kommer grupper av enzymer och lägger till komplementära baser efter varandra längs hela längden av båda DNA-strängarna, det vill säga gen efter gen längs hela kromosomens längd. Sedan i slutändan finns det två identiska kromosomer som är kodade med samma genetiska information.

Komplementär basparning spelar också en viktig roll när celler gör proteiner. Under proteinsyntesen öppnas DNA som är genen som kodar för det protein som behövs –, vilket exponerar sekvenserna av baser i den genen. Sekvensen av baser kopieras sedan i form av RNA, men med en viktig skillnad – har RNA inget T (tymin). Istället för basen tymin använder den en bas som kallas uracil (förkortat U). Så när en gen kopieras under proteinsyntes, matchas varje A i DNA:t med ett U i RNA:t.

Du kan läsa mer om hur cellen omvandlar DNA till fungerande proteiner på – Translation: DNA to mRNA to Protein (Naturutbildning)

Kompletterande basparning har hjälpt forskare att förstå hur cancer uppstår. Till exempel, om de känner till bassekvensen för en bit DNA från en cell, kan de lära sig vad bassekvensen är för den motsatta biten genom att använda komplementär basparning.

Gensekvenseringsteknologi avslöjar uppställningen av baser i DNA och ett budbärar-RNA. Forskare kan sedan använda komplementär basparning för att identifiera genen som producerade det budbärar-RNA:t. När forskarna väl känner till sekvensen av aminosyror i ett protein, kan de dechiffrera sekvensen av baser i budbärar-RNA:t för proteinet och sedan genen som kodar för det proteinet.

Kompletterande basparning gör det också möjligt för forskare att jämföra gener från cancerceller och friska celler från en patient. Detta hjälper dem att lära sig mer om varför cancer uppstår och hur tumörer växer.

Watson och Cricks upptäckt har kallats det viktigaste biologiska verket genom tiderna. Det gav dem också Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1962.


DNA-replikation

I mitos delas cellen isär för att bilda två identiska, samma celler. Det betyder att den har samma #"DNA"# och antal kromosomer som den föregående cellen. Så, mitos huvudfunktion är bokstavligen #"DNA"# replikering.

Svar:

Baspar i DNA-replikation är ett sätt som kromosomerna måste dubbelkolla för att säkerställa att dupliceringen är exakt.

Förklaring:

Baspar i DNA-replikation är ett sätt som kromosomerna måste dubbelkolla för att säkerställa att dupliceringen är exakt.

The replication is termed semiconservative since each new cell contains one strand of original DNA and one newly synthesized strand of DNA. The original polynucleotide strand of DNA serves as a template to guide the synthesis of the new complementary polynucleotide of DNA. A template is a guide that may be used for example, by a carpenter to cut intricate designs in wood.


Introduktion

Topoisomerases unlink DNA during and after replication ( Ullsperger et al., 1995 ). Lk, the linking number of the parental DNA strands, must be reduced to zero for separation of daughter DNA molecules. ΔLk is the difference between Lk and Lk 0 , the value of Lk for the same DNA molecule in relaxed form. The unwinding of parental DNA by replicative helicases causes a compensatory (+)ΔLk that must be removed by topoisomerases. Champoux and Been (1980) suggested that the (+)ΔLk could take the form of (+) supercoils in the unreplicated region as well as windings of the two newly replicated regions around each other. Thus, topoisomerases could unlink replication intermediates (RIs) by acting either in front of or behind the fork. The form of (+)ΔLk in the replicated DNA was subsequently named precatenane, due to structural similarity to catenanes and to distinguish it from the (+)ΔLk in the unreplicated DNA ( Ullsperger et al., 1995 ). Any (+)ΔLk not removed before termination would form catenanes, and these would be unlinked after replication.

This model did not achieve immediate acceptance because early electron microscopy (EM) observations of circular RIs showed supercoils but no precatenanes, suggesting that topoisomerases only act ahead of the fork. However, studies of plasmid replication with purified Escherichia coli enzymes suggested that precatenanes are important in unlinking during replication ( Peng and Marians, 1993 Hiasa and Marians, 1994 , 1996 ). Moreover, both (−) precatenanes and (−) supercoils were observed on purified RIs accumulated by replication of plasmids containing two termination sites in E coli ( Peter et al., 1998). An EM artefact apparently caused earlier studies to miss precatenanes. Finally, a topological analysis of knots trapped within arrested RIs suggested that (−) precatenanes exist in E coli cells ( Sogo et al., 1999 ).

However, removing (−) precatenanes would just increase Lk. Arrested RIs from E coli cells have a (−)ΔLk, presumably due to gyrase activity after replication arrest. Direct evidence for precatenanes on (+)ΔLk RIs, as predicted by Champoux and Been, has been lacking. In fact, (+)ΔLk RIs prepared by adding intercalating agents to purified (−)ΔLk RIs contain neither supercoils nor precatenanes. Instead, the (+) topological stress is relieved by re-annealing of the parental strands and formation of a Holliday junction, a process called fork reversal ( Postow et al., 2001 J.B.Schvartzman, personal communication). It remains unclear, at least in bacteria, whether transient (not arrested) RIs carry a (+) or a (−)ΔLk and whether protein binding inside the cell prevents fork reversal and/or spinning and (+) precatenane formation.

In bacteria, two type 2 topoisomerases can unlink replicating DNA. Gyrase introduces (−) supercoils in front of the forks and may suffice to overcome the (+)ΔLk generated by replication until late RI stages, while topoisomerase IV (topo IV) is responsible for decatenating complete replication products (reviewed in Levine et al., 1998). Studies with purified enzymes support a role for precatenane unlinking by topo IV ( Peng and Marians, 1993 Hiasa and Marians, 1996 ). However, in topo IV mutants, newly synthesized plasmid DNA accumulates as catenanes with the same node number distribution as transient catenanes in wild-type cells ( Zechiedrich and Cozzarelli, 1995 ). Således, in vivo evidence for precatenane removal by topo IV is lacking. In fact, the recent discovery that topo IV relaxes (+) supercoils 20-fold faster than (−) supercoils suggests that it may unlink DNA in front of the fork as efficiently as gyrase ( Crisona et al., 2000 ).

Eukaryotes lack unconstrained (−) supercoils and the (−) supercoiling activity of gyrase. Thus, free (+) supercoils and possibly (+) precatenanes are expected to form during elongation. Both topo I and topo II can remove (+) supercoils in vitro. Studies with yeast mutants showed that replication can initiate in the absence of both enzymes, but elongation stops after a couple of thousand base pairs ( Kim and Wang, 1989 ). Either topo I or topo II (but not topo III) can support further elongation and completion of S phase ( Uemura and Yanagida, 1986 Brill et al., 1987 ). Topo II is strictly required at mitosis for separation of sister chromatids ( Holm et al., 1985 Uemura and Yanagida, 1986 ). Similar observations were made for the replication of naked SV40 DNA in cell-free extracts ( Yang et al., 1987 ) or with purified proteins ( Ishimi et al., 1992b ). The usual interpretation is that either topo I or topo II can remove (+) supercoils to drive elongation, while topo II is required to remove catenane crossings persisting after replication. However, it is unclear whether topo II relaxes (+) supercoils in front of the forks, like topo I, or removes (+) precatenanes behind the forks. Studies of SV40 minichromosome replication in cellular extracts or in infected cells suggest that topo II inhibition in some cases blocks elongation at the late RI stage ( Richter et al., 1987 Ishimi et al., 1992a , b ), but in other cases allows synthesis of complete catenated dimers, even though late RIs accumulate ( Sundin and Varshavsky, 1981 Ishimi et al., 1995 and references therein reviewed in Snapka, 1996 ). Thus, the implication of topo II in the late stages of DNA synthesis in higher eukaryotes is unclear.

Another unresolved issue is what drives decatenation of daughter DNA molecules. In vitro, topo II catalyses both catenation and decatenation of DNA rings, and favours catenation at high DNA concentration ( Krasnow and Cozzarelli, 1982 ). Given the high concentration of DNA in vivo, one expects the equilibrium to be toward catenation. Mechanical separation of sister chromatids during mitosis has been proposed to drive decatenation ( Holm, 1994 Duplantier et al., 1995 ). Although experiments in yeast and Xenopus show that topo II is required for mitotic chromosome condensation and segregation (reviewed in Holm, 1994 ), it is not known whether decatenation is postponed entirely until mitosis or already starts in S or G2 faser.

To investigate these questions, we have studied the effect of topo II inhibition on DNA replication in Xenopus egg extracts. Because studying replication and topology of a long linear chromosome would be difficult, we focused on circular plasmid DNA. Any plasmid DNA incubated in Xenopus egg extracts is replicated under cell cycle control, but only after it has been assembled by the egg extract into chromatin and then into synthetic nuclei, in which replication occurs at discrete foci as in normal nuclei ( Blow and Laskey, 1986 Blow and Sleeman, 1990 Cox and Laskey, 1991 ). Small plasmids (<15 kb) support a single, randomly located initiation event that closely mimics replication of chromosomal domains in early embryonic nuclei ( Hyrien and Méchali, 1992 , 1993 Mahbubani et al., 1992 Lucas et al., 2000). Although caution is required because plasmids may be free of some of the topological restraints of long linear chromosomes, extrapolation from this system to what happens inside cells seems reasonable.

We have analysed the effect of various topo II inhibitors on plasmid DNA replication using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis of replication products. ICRF-193 traps the enzyme in the form of a closed protein clamp without introducing DNA breaks ( Tanabe et al., 1991 ). Etoposide (VP-16) and teniposide (VM-26) poison topo II by stabilizing a covalent reaction intermediate, the cleavable complex. Subsequent treatment with protein denaturants reveals the DNA strand breaks and the covalent linking of a topoisomerase subunit to the 5′ end of the broken DNA ( Chen et al., 1984 ). The covalent intermediates can be extracted selectively with phenol prior to deproteinization. These properties were exploited to map the sites of topo II action during DNA replication. Our results provide direct evidence for the Champoux and Been model in this eukaryotic system, and reveal a division of labour between topo I and topo II. We suggest a role for chromatin assembly in driving DNA unlinking behind the replication fork.


Biologi 171

I slutet av det här avsnittet kommer du att kunna göra följande:

  • Explain how the structure of DNA reveals the replication process
  • Describe the Meselson and Stahl experiments

The elucidation of the structure of the double helix provided a hint as to how DNA divides and makes copies of itself. In their 1953 paper, Watson and Crick penned an incredible understatement: “It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.” With specific base pairs, the sequence of one DNA strand can be predicted from its complement. The double-helix model suggests that the two strands of the double helix separate during replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied. What was not clear was how the replication took place. There were three models suggested ((Figure)): conservative, semi-conservative, and dispersive.


In conservative replication, the parental DNA remains together, and the newly formed daughter strands are together. The semi-conservative method suggests that each of the two parental DNA strands acts as a template for new DNA to be synthesized after replication, each double-stranded DNA includes one parental or “old” strand and one “new” strand. In the dispersive model, both copies of DNA have double-stranded segments of parental DNA and newly synthesized DNA interspersed.

Meselson and Stahl were interested in understanding how DNA replicates. They grew E coli for several generations in a medium containing a “heavy” isotope of nitrogen ( 15 N), which gets incorporated into nitrogenous bases, and eventually into the DNA ((Figure)).


De E coli culture was then placed into medium containing 14 N and allowed to grow for several generations. After each of the first few generations, the cells were harvested and the DNA was isolated, then centrifuged at high speeds in an ultracentrifuge. During the centrifugation, the DNA was loaded into a lutning (typically a solution of salt such as cesium chloride or sucrose) and spun at high speeds of 50,000 to 60,000 rpm. Under these circumstances, the DNA will form a band according to its buoyant density: the density within the gradient at which it floats. DNA grown in 15 N will form a band at a higher density position (i.e., farther down the centrifuge tube) than that grown in 14 N. Meselson and Stahl noted that after one generation of growth in 14 N after they had been shifted from 15 N, the single band observed was intermediate in position in between DNA of cells grown exclusively in 15 N and 14 N. This suggested either a semi-conservative or dispersive mode of replication. The DNA harvested from cells grown for two generations in 14 N formed two bands: one DNA band was at the intermediate position between 15 N and 14 N, and the other corresponded to the band of 14 N DNA. These results could only be explained if DNA replicates in a semi-conservative manner. And for this reason, therefore, the other two models were ruled out.

During DNA replication, each of the two strands that make up the double helix serves as a template from which new strands are copied. The new strands will be complementary to the parental or “old” strands. When two daughter DNA copies are formed, they have the same sequence and are divided equally into the two daughter cells.

Click through DNA Replication (Flash animation).

Section Summary

During cell division, each daughter cell receives a copy of each molecule of DNA by a process known as DNA replication. The single chromosome of a prokaryote or each chromosome of a eukaryote consists of a single continuous double helix. The model for DNA replication suggests that the two strands of the double helix separate during replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied. In the conservative model of replication, the parental DNA is conserved, and the daughter DNA is newly synthesized. The semi-conservative model suggests that each of the two parental DNA strands acts as template for new DNA to be synthesized after replication, each double-stranded DNA retains the parental or “old” strand and one “new” strand. The dispersive model suggested that the two copies of the DNA would have segments of parental DNA and newly synthesized DNA. The Meselson and Stahl experiment supported the semi-conservative model of replication, in which an entire replicated chromosome consists of one parental strand and one newly synthesized strand of DNA.

Gratis svar

How did the scientific community learn that DNA replication takes place in a semi-conservative fashion?

Meselson’s experiments with E coli grown in 15 N deduced this finding.

Imagine the Meselson and Stahl experiments had supported conservative replication instead of semi-conservative replication. What results would you predict to observe after two rounds of replication? Be specific regarding percent distributions of DNA incorporating 15 N and 14 N in the gradient.

Following two rounds of conservative replication, two bands would be detected after ultracentrifugation. A lower (heavier) band would be at the 15 N density, and would comprise 25% of the total DNA. A second, higher (lighter) band would be at the 14 N density, and would contain 75% of the total DNA.


DNA-replikation

Since DNA forms the genetic code and that it is known that genes may be inherited, it follows that DNA must be copied exactly before being incorporated into gametes at meiosis.

It also follows that all new cells in an organism must gain a copy of the genes at mitosis, because they are able to continue the characteristic biochemical behaviour of that organism.

What is the mechanism for this exact copying or replikering of the DNA?

Three theories existed:

  1. The parent DNA molecule breaks into segments and new nucleotides fill in the gaps precisely (fragmentation theory).
  2. The complete parent DNA molecule acts as a template for the new daughter molecule, which is assembled from new nucleotides. The parent molecule is unchanged (konservativ hypothesis).
  3. The parent DNA molecule separates into its two component strands, each of which acts as a template for the formation of a new complementary strand. The two daughter molecules therefore contain half the parent DNA and half new DNA (halvkonservativ hypothesis).

The semi conservative hypothesis

The semi conservative hypothesis was shown to be the true mechanism by the work of Meselsohn and Stahl (1958).

In their experiment they grew the bacterium E coli in the presence of radioactive 15 N until a culture was obtained in which all the DNA was labelled with 15 N.

A subculture of this labelled bacterium was than transferred for growth in the presence of normal 14 N. The generation time of E coli is known, so it was possible to take samples of this growing subculture after exactly one, two, three generations and so on.

Each sample had its DNA extracted and the isolated DNA was then centrifuged in a caesium chloride solution (high viscosity) at 40,000G for 20 hours, causing the DNA to sediment out.

The heavier the DNA, the further it moved down the centrifuge tubes. 15 N DNA is heavier than 14 N DNA. Blandad 14 N och 15 N DNA is intermediate in mass between the two.

Originalet 15 N DNA moved to the lowest position in the tube.

After one generation all the DNA moved to an intermediate position, indicating the presence of only mixed 14 N and 15 N DNA. This was because the DNA in this generation contained one strand of the parent molecule and one new 14 N strand.

Had the conservative hypothesis been true, two DNA masses would have been visible, one heavy and the other light.

In the second generation half the DNA was intermediate and half was light, for the same reason.

Process of DNA replication

The actual process is simple. To begin with one strand in the DNA duplex is nicked by the enzyme DNA topoisomerase, allowing part of the molecule to unravel to form a replikationsgaffel (the DNA is replicated a bit at a time and the whole molecule is never completely uncoiled).

Next, the enzyme DNA-helikas splits the two strands by breaking the hydrogen bonds. This exposes the bases.

DNA -polymeras enzyme then moves along the exposed bases sequences, creating a new complementary strand as it goes. DNA polymerase reads the exposed code from the 3' to the 5' end and therefore assembles the new strand from the 5' to the 3'.

Several molecules of DNA polymerase act simultaneously, each assembling a separate section of the new strand of DNA. Each DNA polymerase is preceded by an RNA-polymeras enzyme, which constructs an RNA primer to guide the action of the DNA polymerase.

These new DNA segments are then joined together by the enzyme DNA-ligas. The two new daughter molecules then coil up again to reform the double helix structure. This process occurs during the S -fas av cellcykel.


Titta på videon: DNA Replikation. Vervielfältigung einfach erklärt - Verlauf, Replikationsenzyme, Replikationsfehler (December 2022).