Information

Analys för beta-galaktosidasaktivitet i enkelcellsmikroskopi

Analys för beta-galaktosidasaktivitet i enkelcellsmikroskopi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jag skulle vilja kunna mäta aktiviteten av $eta$-galaktosidas i levande celler med enkel optisk (kanske fluorescens) mikroskopi. Helst skulle jag vilja göra ett minimum av genteknik och använda den här analysen med stammar jag redan har (som har ett WT-laktossystem), det vill säga en fluorescerande laktoshärmare skulle vara idealisk. Dessutom skulle det vara trevligt om livslängden för den fluorescerande biprodukten av $eta$-gal aktivitet var kort, så att jag kunde upptäcka en minskning av $eta$-gal aktivitet såväl som en ökning. Finns en sådan fluorescerande analog? Jag hoppas kunna se övergången från laktos till glukosanvändning under mikroskopet, så jag vill att laktosanvändande celler ska lysa upp och celler som använder glukos ska vara mörka, eller vice versa. Det behöver inte vara helt kvantitativt – en kvalitativ mening är bra.


Jag hittade detta papper.

Zhang GJ et al. (2009) In vivo optisk avbildning av LacZ-uttryck med användning av lacZ-transgena möss. Assay Drug Dev Technol.7:391-9. doi: 10.1089/adt.2009.0195.

Abstrakt

beta-galaktosidas (beta-gal) (kodas av lacZ-genen) har använts i stor utsträckning som ett transgenreporterenzym. Förmågan att avbilda lacZ-uttryck i levande transgena djur skulle ytterligare utöka användningen av denna reporter. Det har rapporterats att 7-hydroxi-9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on)-beta-d-galaktopyranosid (DDAOG), ett konjugat av beta-galaktos och 7-hydroxi-9H -(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on), är inte bara ett kromogent lacZ-substrat utan att klyvningsprodukten har långt röda fluorescensegenskaper som kan detekteras med in vivo-avbildning. I ett försök att icke-invasivt avbilda lacZ-uttryck in vivo applicerade vi fluorescensavbildning på en G-proteinkopplad receptor (GPR56), knockout (KO) musmodell, där lacZ-genen introduceras i GPR56-lokuset. Jämfört med möss av vildtyp (WT), visade GPR56KO/LacZ-möss tre till fyra gånger högre fluorescensintensitet i huvudområdet 5 minuter efter svansveninjektion av DDAOG. beta-Gal-färgning i sektioner av hela hjärnan visade starkt lacZ-uttryck i homozygoter, men inte i WT-möss, i överensstämmelse med lacZ-aktivitet detekterad med in vivo-avbildning. Njurarna visualiserades också med fluorescensavbildning både in vivo och ex vivo, i överensstämmelse med beta-gal-färgningsfynd. Våra resultat visar att fluorescensavbildning kan användas för in vivo realtidsdetektering av lacZ-aktivitet genom fluorescensavbildning i lacZ-transgena möss. Således kan denna teknologi potentiellt användas för att icke-invasivt avbilda förändringar av vissa endogena molekyler och/eller molekylära vägar hos transgena djur.

Arbetet i tidningen citeras i en nyare tidning som rapporterar beta-gal-baserad kemiluminescerande avbildning hos möss.

Det är oklart om något av detta skulle vara framgångsrikt på en enda bakteriecellsnivå.


Jag postade detta som ett svar eftersom det var för långt för en kommentar. I allmänhet är ditt experimentella tillvägagångssätt genomförbart, men djävulen ligger i detaljerna.

För det första blir din största utmaning att få tillgång till lämplig optik. Avbildning av individuella eukaryota celler är relativt lätt med alla diffraktionsbegränsade optiska mikroskop, eftersom deras skala vanligtvis är 10-20 $mu$m. Bakterier har en mycket mindre cellstorlek, och de (för det mesta) kan inte avbildas med diffraktionsbegränsade tekniker på en enda cellnivå. För att avbilda en enda cell krävs optik/teknik med superupplösning.

För det andra låter det som att du gör diauxiska växlingskurvor. Det kanske inte är nödvändigt att avbilda på en enstaka cellnivå, och du kanske kan komma undan med att göra bra mätningar av celler i aggregat med vilket kamerautrustat mikroskop som helst, eller till och med en optisk plattläsare eftersom du nämnde $eta$- tjej.

@Alan Boyd påpekade ett kemiluminescerande substrat för $eta$-gal som skulle kunna fungera bra om du har tillgång till en optisk avbildare som kan ge dig avläsningar av fotonantal/sekund. Detta skulle ge dig avläsningar av genomsnittlig enzymaktivitet (som du kan korrelera till uttrycksnivå).

Du beskriver också att cellerna är ljusa/mörka beroende på det använda substratet och det skulle vara svårare att uppnå. Det finns många sätt jag föreställer mig att göra detta på, men de kräver alla en viss mängd genetisk manipulation. Det enklaste kanske är att göra en expressionsplasmid som placerar LacZ under kontroll av en IPTG-inducerbar promotor. Dessa plasmider är mycket vanliga och skulle ge dig en enkel ingång till bild laktosanvändning.


Här är en länk till Invitrogen/Life Technologies webbsida som beskriver olika prober för att detektera aktiviteten av glykosidaser, inklusive $eta$-galaktosidas. Dessa inkluderar DDAOG som nämnts av @Alan Boyd, såväl som Fluorescein Digalactoside, Resorufin Galactoside och Methylumbelliferyl Galactoside, bland andra. OBS, detta är en Invitrogen/Life Technologies-webbplats, så alla reagenser de nämner är sådana som säljs av företaget; det kan finnas andra som inte nämns här. Av dessa är DDAOG mycket stabil, vilket skulle göra det möjligt att mäta initieringen av $eta$-gal aktivitet, men kanske inte fungerar för att mäta minskningar i $eta$-gal aktivitet (utan att bleka färgämnet). Resorufin Galactoside är känslig och stabil vid fysiologiskt pH, vilket möjliggör mätning under en lång tidsperiod. Fluorescein Digalactoside är den mest känsliga analysen, men eftersom den kräver borttagning av 2 galaktosdelar för full fluorescens kan aktiveringstiden vara långsam.

För min speciella användning (begränsad tillgång till nästan röda frekvenser) tror jag att Resorufin Galactoside eller Fluorescein Digalactoside kan vara de bästa valen. Men med tanke på kostnaden för dessa sönder, kan jag vara bättre av att bara hitta något labb med en stam med gfp under lac-promotom i kromosomen och be dem om ett prov!


Protokoll för att detektera senescens-associerad beta-galaktosidas (SA-βgal) aktivitet, en biomarkör för åldrande celler i kultur och in vivo

Normala celler kan permanent förlora förmågan att föröka sig när de utmanas av potentiellt onkogen stress, en process som kallas cellulär senescens. Åldringsassocierad beta-galaktosidas (SA-pgal) aktivitet, detekterbar vid pH 6,0, möjliggör identifiering av åldrande celler i kultur och däggdjursvävnader. Här beskriver vi först ett cytokemiskt protokoll som är lämpligt för histokemisk detektering av enskilda senescentceller både i kultur och vävnadsbiopsier. Den andra metoden är baserad på alkalinisering av lysosomer, följt av användning av 5-dodekanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C12FDG), ett fluorogent substrat för βgal-aktivitet. Den cytokemiska metoden tar cirka 30 minuter att utföra, och flera timmar till en dag att utveckla och göra poäng. Fluorescensmetoderna tar mellan 4 och 8 timmar att utföra och kan poängsättas på en enda dag. Den cytokemiska metoden är tillämpbar på vävnadssnitt och kräver enkla reagenser och utrustning. De fluorescensbaserade metoderna har fördelarna att de är mer kvantitativa och känsliga.


Metoder för att upptäcka biomarkörer för cellulär senescens: den åldrandeassocierade beta-galaktosidasanalysen

De flesta normala mänskliga celler genomgår cellulär senescens efter att ha samlat på sig ett bestämt antal celldelningar, eller utmanas av en mängd olika potentiellt onkogena stimuli, i odling och troligen in vivo. Cellulär senescens kännetecknas av ett irreversibelt tillväxtstopp och vissa förändrade funktioner. Åldrande celler i kultur identifieras av deras oförmåga att genomgå DNA-syntes, en egenskap som också delas av vilande celler. För flera år sedan beskrev vi en biomarkör associerad med den åldrande fenotypen, en åldringsassocierad beta-galaktosidas (SA-beta-gal), som detekteras genom histokemisk färgning av celler med det konstgjorda substratet X-gal. Närvaron av SA-beta-gal-biomarkören är oberoende av DNA-syntes och skiljer i allmänhet åldrande celler från vilande celler. Metoden för att detektera SA-beta-gal är en bekväm, encellsbaserad analys, som kan identifiera åldrande celler även i heterogena cellpopulationer och åldrande vävnader, såsom hudbiopsier från äldre individer. Eftersom det är lätt att upptäcka är SA-beta-gal för närvarande en allmänt använd biomarkör för åldrande. Här beskriver vi en metod för att upptäcka SA-beta-gal i detalj, inklusive några nya modifieringar.


Encells epigenetisk visualiseringsanalys

Karakterisering av den epigenetiska statusen hos enskilda celler är fortfarande en utmaning. Nuvarande sekvenseringsmetoder har begränsad täckning, och det är svårt att tilldela en epigenetisk status till transkriptionstillståndet för individuella genalleler i samma cell. För att ta itu med dessa begränsningar utvecklades en riktad mikroskopibaserad epigenetisk visualiseringsanalys (EVA) för detektion och kvantifiering av epigenetiska märken på gener av intresse i enstaka celler. Analysen är baserad på en biokemisk reaktion in situ mellan ett antikroppskonjugerat alkaliskt fosfatas bundet till det epigenetiska märket av intresse och en 5'-fosforylerad fluorofor-märkt DNA-oligo bunden till en målgen med genspecifika oligonukleotider. När det epigenetiska märket är närvarande vid genen, skyddar fosfatgruppsavlägsnande av fosfataset oligon från λ-exonukleasaktivitet och ger en kvantitativ fluorescerande avläsning. Vi tillämpade EVA för att mäta 5-metylcytosin (5mC) och H3K9Ac nivåer vid olika gener och HIV-1 provirus i mänskliga cellinjer. För att koppla epigenetiska märken till gentranskription kombinerades EVA med RNA-FISH. Högre 5mC-nivåer vid tystade jämfört med transkriberade XIST-genalleler i kvinnliga somatiska celler validerade detta tillvägagångssätt och visade att EVA kan användas för att relatera epigenetiska märken till transkriptionsstatusen för individuella genalleler.

© The Author(s) 2021. Publicerad av Oxford University Press på uppdrag av Nucleic Acids Research.

Siffror

Epigenetisk märkesvisualisering vid en...

Epigenetisk markvisualisering vid en gen av intresse. Alkaliskt fosfatas (AP) rekryteras...

RNA-FISK—EVA-analys av rDNA...

RNA-FISK—EVA-analys av rDNA-lokus. ( A ) rDNA-transkriptionsenhet och...

Intryckt XIST-gen. ( En…

Intryckt XIST-gen. ( A ) Humant XIST-genlokus och sonddesign.…

Lösnummer EGR1 gen. (…

Lösnummer EGR1 gen. ( A ) Människan EGR1 genlokus och sond...

HIV-provirus hos latent infekterade...

HIV-provirus i latent infekterade celler. ( A ) Schematisk översikt över...

Histonmodifiering H3K9Ac EVA-analys...

Histonmodifiering H3K9Ac EVA-analys av rDNA. ( A ) H3K9Ac-EVA-analysen var...


SA-β-galaktosidasbaserad screeninganalys för identifiering av senoterapeutiska läkemedel

Cellulär senescens är nyckelfaktorn i utvecklingen av kroniska åldersrelaterade patologier. Identifiering av läkemedel som riktar sig mot åldrande celler visar lovande för att förlänga hälsosamt åldrande. Här presenterar vi en ny analys för att screena för identifiering av senoterapeutika baserat på mätning av senescensassocierad β-galaktosidasaktivitet i enstaka celler.

Vi beskriver här för första gången en metod som möjliggör screening av läkemedel med hög genomströmning för senoterapeutiska föreningar som har visat sig vara fördelaktiga vid åldranderelaterade sjukdomar. Faktum är att flera kliniska prövningar med läkemedel som testats i detta väsen pågår för närvarande. Den största fördelen med denna teknik är att skilja mellan två typer av senoterapeutiska läkemedel, senolytika och senomorfa, genom att använda den väletablerade detektionen av SA-beta-galaktosidas i åldrande celler.

Denna teknik är ett viktigt screeningsverktyg för nya senoterapeutiska föreningar. Faktum är att flera föreningar som har identifierats med hjälp av denna skärm visas i olika högprofilerade publikationer och är för närvarande i klinisk prövning. Denna teknik är extremt mångsidig och kan anpassas till flera skärmar med hög genomströmning.

Faktum är att det är möjligt att multiplexa screeningar och screena för föreningar som undertrycker åldrande via aktivering eller hämning av en av flera vägar. Hacka varje embryo i bitar på en millimeter och rör det upp och ner flera gånger. Tillsätt sedan 10 milliliter tillväxtmedium till vävnaderna i varje embryo.

Platta dem i en 10 centimeters odlingsskål och inkubera vid 37 grader Celsius i 3 % syre och 5 % koldioxid i två till tre dagar. Och inkubera resten av varje embryo med 0,25% trypsin EDTA-blandning i 10 minuter. För att trypsinisera celler, ta först försiktigt bort tillväxtmediet och tvätta cellerna med 10 milliliter 1X PBS två gånger.

Tillsätt sedan två milliliter av en 025 trypsin EDTA-lösning till cellerna och inkubera dem vid 37 grader Celsius i två till tre minuter. Inspektera sedan cellerna under ett mikroskop för att se till att cellerna lossnar från ytan. Tillsätt samma mängd odlingsmedium för att avsluta trypsin-nedbrytningen och överför cellerna till ett koniskt rör.

Centrifugera sedan cellerna vid 200 gånger G i tre minuter. Kassera supernatanten och tillsätt färskt tillväxtmedium för att återsuspendera cellerna. Räkna sedan cellerna och så dem i nya plattor med den projicerade celldensiteten.

För subkultivering utan åldrande, först, dela sammanflytande celler i ett ett-till-fyra-förhållande. Inkubera sedan cellerna vid 37 grader Celsius i 3 % syre och 5 % koldioxid för att förlänga för ytterligare en passage. Därefter, för att inducera cellåldring, delade frön sammanflytande celler från passage ett i ett förhållande av ett till fyra och inkubera dem vid 37 grader Celsius i en miljö med 20 % syre och 5 % koldioxid i tre dagar.

För att övervaka cellulär senescens, med ett avancerat Coulter Cell Counter-system, mät den gradvisa ökningen av celldiameter och cellvolym under varje trypsiniseringssteg. För att börja beta-Gal-screeningsanalys, så 5 000 åldrande celler eller 3 000 icke-åldrande celler per brunn i plattor med 96 brunnar. Tillsätt sedan 100 mikroliter tillväxtmedium till varje brunn och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius och 20 % syre och 5 % koldioxid i sex timmar.

Tillsätt sedan läkemedelsspädningar till MEF-celler och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 20 % syre och 5 % koldioxid i 24 till 48 timmar. Efter inkubation, ta bort läkemedelslösningen och tvätta cellerna med 100 mikroliter 1X PBS. För att inducera lysosomal alkalinisering, förbehandla celler med 90 mikroliter bafilomycin A1-lösning, utspädd i färskt cellodlingsmedium vid en slutlig koncentration av 100 nanomolar.

Inkubera sedan cellerna vid 37 grader Celsius i en miljö med 20 % syre och 5 % koldioxid i en timme. För fluorescensanalys av SA-beta-Gal-aktivitet, gör en färsk arbetslösning av C12FDG utspädd i tillväxtmedium, vid en slutlig koncentration av 100 mikromolar. Tillsätt sedan 10 mikroliter av arbetslösningen till odlingsmediet vid en slutlig koncentration av 10 mikromolar och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 20 % syre och 5 % koldioxid i två timmar.

Tvätta cellerna med 100 mikroliter 1X PBS. Tillsätt sedan två mikroliter av ett 100 mikrogram per milliliter Hoechst 33342 färgämne i en slutlig koncentration av två mikrogram per milliliter. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius, 20 % syre och 5 % koldioxid i 20 minuter.

Efter inkubation, ta bort mediet, tillsätt 100 mikroliter färskt tillväxtmedium och fortsätt till bildbehandling. I denna studie möjliggjorde en höghaltig fluorescerande bildinsamling och analysplattform identifiering av senolytiska läkemedel, såsom 17-DMAG, som minskade de övergripande SA-beta-Gal-aktiviteterna i murina embryonala fibroblastcellkulturer innehållande senescenta celler i passage fem. De mjukvarugenererade kvantitativa analyserna av blandningar av åldrande och icke-åldrande celler möjliggör en tydlig demonstration av åldrande cellspecifika effekter och eliminering av bakgrundsbeta-galaktosidasaktivitet av bafilomycin A. Se till att alla nödvändiga cellkontroller är inkluderade, särskilt obehandlade åldrande celler och åldrande celler behandlade med en positiv kontroll.

Den här uppsatsen inkluderar att arbeta med primära celler under oxidativ stress, vilket kan leda till variation som måste övervakas. Denna procedur är det första steget i upptäckten av senoterapeutiska läkemedel. Ytterligare cellviabilitet och cellåldrande uppsatser måste utföras för att bekräfta screeningsresultaten.

Flera nya senolytiska läkemedel har upptäckts med denna uppsats, inklusive den första senolytiska läkemedelskombinationen dasatinib quercetin, värmechockprotein 90-hämmare, Bcl-2-familjenshämmare och polyfenol fisetin.


Analys för beta-galaktosidasaktivitet i enkelcellsmikroskopi - Biologi

En omfattande genomgång av analyser för cellproliferation och cellviabilitet, tillsammans med resultaten från en Labome-undersökning av formella publikationer.

Det finns många metoder och kit tillgängliga för närvarande som används för att mäta många aspekter av cellproliferation, mitokondriell funktion och, indirekt, cellviabilitet. Överanalys av dessa analyser och felaktig tolkning av informationen de tillhandahåller blir dock allt vanligare i den publicerade litteraturen. I en cellproliferationsanalys bör utdata ge dig en direkt och korrekt mätning av antalet aktivt delande celler i en population, vare sig det är celler i kultur eller vävnader. Däremot är en cellviabilitetsanalys utformad för att ge en indikation på antalet "friska" celler inom en population, ofta genom att bedöma specifika indikatorer på metaboliskt aktiva celler, ofta relaterade till mitokondriell funktion. Till skillnad från en proliferationsanalys, skiljer dessa mätningar inte mellan vilande/åldrande och aktivt delande celler. Beta-galaktosidasaktivitetsanalys eller färgning kan indikera åldrande celler [1]. Analyser för cellcykelanalys och celldöd diskuteras på annat håll.

Etikettfria tillvägagångssätt, såsom xCELLigence RTCA SP/DP Real Time Cell Analyzer från ACEA Biosciences, kan mäta ökningen av cellantal och därmed kvantifiera cellvidhäftningen, proliferationen, lossnandet/döden [2, 3].

Den traditionella metoden för att analysera cellproliferation är att mäta DNA-syntes genom att bedöma inkorporeringen av en märkt DNA-analog eller prekursor (5-bromo-2'-deoxiuridin (BrdU), en analog av pyrimidin som införlivas med nytt DNA i stället av tymidin, eller ΑH]-tymidin) in i det genomiska DNA:t hos celler under S-fasen av cellcykeln. Till exempel bedömde Maun HR et al proliferationen av bronkiala glatta muskelceller med 3H-tymidininkorporering [4]. För celler i kultur är den vanligaste metoden att bedöma BrdU-inkorporering genom kolorimetrisk ELISA (Figur 1). Liknande metoder kan användas för att bedöma prolifererande celler in vivo genom att pulsmärka vävnader med BrdU före skörd, följt av bedömning av BrdU med ELISA eller immunhistokemisk färgning. Detta kan också bedömas med flödescytometri, ett exempel på spår av BrdU vs. 7-AAD visas i figur 2.

Ett nyare tillvägagångssätt är att införliva den alkyninnehållande tymidinanalogen EdU (5-etynyl-2´-deoxiuridin) i DNA och detektera den inkorporerade EdU genom en klickreaktion - en kopparkatalyserad azid-alkyncykloaddition [5] - i fallet av märkning i levande djur kan EdU antingen injiceras eller blandas i dricksvattnet [6]. Ouadah Y et al injicerade, ip, BrdU och Edu dagligen i möss och detekterade de märkta cellerna genom en anti-BrdU-antikropp (Abcam ab6326) och Click-iT EdU-kit från Thermo Fisher på kryosektionerna för att undersöka aktiveringen av pulmonella neuroendokrina celler [ 7]. En Marconi et al pulsjagad kondrogenes i embryonal och vuxen skridsko, Leucoraja erinacea genom EdU-märkning och detektion med Click-iT EdU Cell Proliferation Kit från Thermo Fisher [8]. Prolifererande EdU+-celler kan också detekteras genom flödescytometri med Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kit från Thermo Fisher [9].

BrdU i sig kan påverka cellfysiologin. Det kan främja transkriptionsfaktor- och kemisk-inducerad omprogrammering [10] och kan också förändra DNA-strukturen [11].

SymProteinTopp tre leverantörer
H3-3AH3.3 histon ACell Signaling Technology 9733 (107), Abcam ab14955 (31), Active Motiv 39763 (18)
MCM2minkromosomunderhållskomplex komponent 2Cell Signaling Technology 3619 (7), BD Biosciences 610700 (5), Abcam ab108935 (2)
MKI67markör för spridning Ki-67Invitrogen MA5-14520 (771), Dako M7240 (271), Abcam ab16667 (193)
PCNAprolifererande cellkärnantigenSanta Cruz Biotechnology sc-56 (190), Invitrogen MA5-11358 (181), Abcam ab29 (71)

I sektioner av fixerade djurvävnader och cellpopulationer bedöms proliferation vanligtvis genom immunfärgning för specifika proliferativa markörer, av vilka några beskrivs här. Ki-67 är ett nukleärt protein associerat med cellproliferation och ribosomal RNA-transkription [12] och ofta används [13]. Traditionella Ki67-antikroppar är begränsade genom att de endast kan användas för att färga frysta, och inte paraffininbäddade sektioner. Emellertid kan nya MIB-1-antikroppar, riktade mot en annan epitop av Ki67, också användas för att färga formalin och paraffinfixerade sektioner, vilket ökar tillämpningen av Ki67 som en proliferativ markör. Ouadah Y et al färgade kryosektioner av muslungor med Ki-67-antikroppar (Thermo Fisher 41-5698-82 och 50-5698-82) för att undersöka skada-inducerad neuroendokrin cellproliferation [7]. Nam S et al använde Ki-67-färgning och flödescytometri för att uppskatta fraktion av celler från 3D-hydrogelkultur i G0- och G1-faserna av cellcykeln [14]. Hu CK et al, å andra sidan, färgade celler vid G2/M-övergången av cellcykeln i killifish-embryon med Hoechst och antikroppar mot fosfo-Histone H3 (Ser10) för att bedöma cellproliferation [15].

Prolifererande cellkärnantigen (PCNA) är en annan vanligen använd markör för cellproliferation. Det påskyndar DNA-syntesen med DNA-polymeras-δ genom att omringa genomet vilket underlättar replikationen genom att hålla polymeraset till DNA:t. Det uttrycks därför i kärnan under DNA-syntes och kan som sådan användas som en markör för cellproliferation. Det spelar också viktiga roller i DNA-reparation. Andra prolifererande markörer inkluderar MCM2 [16].

Alla analyser som antingen direkt eller indirekt mäter DNA-syntes är i sig känsliga för stadiet av cellcykeln. Beroende på resultatet av analysen kan det därför vara nödvändigt att synkronisera cellerna, antingen genom serumabstinens som ackumulerar celler i G1 (vilket också kan påverka livskraften) eller kemiskt hämma DNA-syntesen, blockera celler i S-fasen, med tymidin cytosinarabinosid, hydroxiurea eller aminopterin. Dessutom kan cellproliferation också mätas genom övervakning av celldelning genom att använda till exempel Cell Proliferation Dye eFluor™ 670 från Thermo Fisher [17].

Cellbaserade analyser för att mäta livsduglighet kan huvudsakligen delas in i tre kategorier: de som utnyttjar förlusten av membranintegritet, de som direkt mäter metaboliska markörer och de som bedömer metabolisk aktivitet. Det finns andra former av upptäckt. Kristallviolett färgning kan kontrollera vidhäftningen av celler och därmed mäta viabiliteten av vidhäftande celler [18]. Till exempel använde Lee YR et al kristallviolett färgning för att bedöma effekterna av PTEN K342/K344R-mutant på spridningen av PC3-celler [19]. Vasan N et al färgade fixerade MCF10A-celler med kristallviolett för att mäta cellproliferation [20].

  • MTT: MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) är ett tetrazoliumsalt som reduceras av både mitokondriella och extramitokondriella dehydrogenaser för att bilda olösliga blå formazankristaller, vilket betyder ett solubiliseringssteg krävs innan analysen kan avläsas [21]. Dessutom blir celler icke-livsdugliga under denna analys, vilket innebär att upprepade eller komplementära analyser inte kan utföras på samma platta av celler.
  • MTS/XTT: MTS (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboximetoxifenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium) och XTT (2,3-bis-( 2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid)-substrat liknar MTT. En fördel är dock att reaktionerna utförs intracellulärt i närvaro av den intermediära elektronacceptorn fenazinmetosulfat (PMS), vilket ökar deras känslighet. Dessutom är den reducerade formazanprodukten löslig och frigörs till odlingsmediet, vilket tar bort behovet av det extra löslighetssteg som krävs med MTT. Men fenolrött i cellodlingsmedia, fettsyror och serumalbumin har alla rapporterats förvränga data erhållna från MTS-, XTT- och WST-analyser under långa inkubationsperioder [22]. Promega RealTime Glo MT Cell Viability Assay utforskar den reduktiva miljön inuti celler för att reducera en kemikalie till ett lämpligt substrat för NanoLuc luciferas. Reynders M et al, till exempel, mätte cellcytotoxicitet och proliferation med en MTS-analys [23].
  • Alamar Blue: Alamar Blue är en resazurinförening som reduceras till resorufin och dihydroresorufin i livskraftiga celler. Den kan komma in i levande celler så kräver inte cellys och är stabil i odlingsmedia. Denna analys har den extra fördelen att den kan mätas i både fluorimetriska och kolorimetriska plattläsare. Silva MC et al använde Thermo Fisher Alamar Blue-reagens för att mäta cellviabiliteten hos inducerade pluripotenta cellhärledda neurala stamfaderceller vid behandling av tau-proteinnedbrytare QC-01–175 [24]. Dominy SS et al mätte livsdugligheten hos humana neuroblastom SH-SY5Y-celler utmanade med Porphyromonas gingivalis med eller utan gingipainhämmare eller antibiotika med hjälp av Thermo Fisher Alamar Blue-reagens [25].
  • WST: Vattenlösliga tetrazoliumsalter (WSTs) är cellogenomträngliga tetrazoliumfärgämnen som reduceras extracellulärt via plasmamembranelektrontransport [26], och kombineras med elektronacceptorn PMS för att generera vattenlösliga formazanfärgämnen. Noda S et al, till exempel, undersökte livsdugligheten hos primära tandmassastamceller med Cell Counting Kit-8 (innehållande WST-8-lösning, även kallad CCK-8-analys), från Dojindo Laboratories [27]. L Zhao et al använde samma kit för att mäta tumörcellsproliferation i kultur [28]. Luther A et al använde ett liknande WST-8-kit, men från MilliporeSigma, för att mäta cytotoxiciteten hos potentiella antibiotika på HeLa- och HEP G2-celler [29].

Det finns många tillgängliga analyser som mäter ATP-nivåer som ett resultat av övergripande cellhälsa. När celler börjar genomgå apoptos eller förlorar membranintegritet, blir ATP-lager uttömda genom aktiviteten av ATPaser som samtidigt förhindrar ny ATP-syntes. Detta leder till en snabb utarmning av intracellulära ATP-nivåer. Luminescerande ATP-analyser (som Promegas CellTiter-Glo) fungerar genom att lysera celler för att frigöra ATP-lager, samtidigt som de hämmar ATPaser. Luciferas katalyserar oxidationen av luciferin till oxyluciferin i närvaro av magnesium och ATP, vilket resulterar i en luminescerande signal som direkt korrelerar med den intracellulära ATP-koncentrationen [30, 31].

Det finns ett antal beslut att fatta när man väljer lämplig metabolisk analys för dina behov. Vart och ett av substraten listade ovan, och relaterade sådana som inte täcks här, har sina distinkta fördelar och nackdelar när de jämförs direkt. Analyskänslighet, brus/signalförhållande, användarvänlighet och reagensstabilitet är alla faktorer att ta hänsyn till. Ett ytterligare viktigt övervägande med metaboliska analyser är att minskningen av dessa substrat påverkas av förändringar i intracellulär metabolisk aktivitet som inte har någon direkt effekt på den totala cellviabiliteten, därför kommer frågan du försöker svara på spelar en nyckelroll i valet av lämpliga analyser.

  • LDH: Laktatdehydrogenas är ett allestädes närvarande, stabilt cytoplasmatiskt enzym som omvandlar laktat till pyruvat. Om cellmembranet har skadats frigörs LDH och därför dess enzymatiska aktivitet från celler och kan detekteras i cellodlingsmedia. Under omvandlingen av laktat till pyruvat reduceras NAD+ till NADH/H+. LDH-baserade livskraftsanalyser drar nytta av bildningen av den fria vätejonen genom att katalysera överföringen av H+ från NADH/H+ till tetrazoliumsaltet INT (2-(4-jodfenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyltetrazoliumklorid ), reducera det till ett rött formazanfärgämne [32], eller omvandling av resazurin till den fluorescerande formen resorufin i Promega CytoTox-ONE-analys [33]. Persson EK et al använde Pierce LDH cytotoxicitetsanalyskit för att mäta nekrotisk celldöd på grund av Charcot-Leyden-kristaller [34].
  • Trypanblått: Färgning av en cellsuspension med trypanblått är en av de äldsta och enklaste viabilitetsanalyserna [35, 36]. I en frisk, livskraftig cell kommer det intakta membranet att hindra trypanblått från att komma in i cellerna. I döda eller döende celler kommer trypanblått in i cellen och färgar den blå. Denna metod kvantifierades traditionellt manuellt med hjälp av mikroskop och hemocytometrar, vilket gjorde den mycket arbetsintensiv. Men den senaste tidens tillgänglighet av prisvärda automatiserade cellräknare, till exempel Bio-Rad TC20 automatiserad cellräknare [36] eller Vi-CELL™ automatiserad cellviabilitetsanalysator och räknare från Beckman Coulter [37], gör denna analys mindre tidskrävande och mer exakt än tidigare. Andra liknande men fluorescerande färgämnen kan också användas. Till exempel identifierade Aizarani N et al livsdugliga celler med en cellsorterare genom Zombie Green från BioLegend [38].
  • Calcein-AM: Calcein-acetoximetylester är ett icke-fluorescerande färgämne som används i både cellviabilitets- och apoptosanalyser, till exempel för att detektera cytotoxiciteten hos Abeta-peptiden och dess oligomerer [39]. Det är lipofilt, vilket tillåter enkel passage genom cellmembranet. Väl inne i cellen klyver intracellulära esteraser esterbindningarna i acetometoxigruppen, vilket resulterar i bildandet av ett fluorescerande anjoniskt och hydrofilt kalceinfärgämne, som fastnar inuti cellen. Icke-viabla celler innehåller inte aktiva esteraser, vilket gör att denna analys kan användas som ett mått på livsduglighet. Cu 2+, Co 2+, Fe 3+, Mn 2+ och Ni 2+ dämpar den fluorescerande signalen från calcein vid fysiologiskt pH, vilket innebär att man måste vara noggrann med att välja lämpligt cellodlingsmedium.
  • Propidiumjodid/7-AAD: Dessa interkalerande medel används ofta för att studera cellcykeln som diskuterats ovan. Men eftersom de är membranogenomträngliga utesluts de från livsdugliga celler. Detta innebär att fluorescenssignalen som emitteras av PI eller 7-AAD i icke-viabla celler kan mätas antingen med fluorescensmikroskopi [40] eller FACS-analys [41-43]. Till exempel utvärderade Nortley R et al pericytcelldöden med 7,5 uM propidiumjodid [44]. Capello M et al använde IncuCyte™ Cytotox Green Reagent från Essen Bioscience för att mäta celldöden bland odlade cancerceller [45].
  • Cellogenomträngliga DNA-bindande färgämnen såsom DRAQ7 från Abcam [46] eller SYTOX från Thermo Fisher. Dessa färgämnen kommer in i cellerna genom komprometterade cellmembran och visar stark fluorescens vid bindning med DNA. Till exempel övervakade Samir P et al celldöd i odlade benmärgshärledda makrofager i realtid med SYTOX Green-färgning under ett tvåfärgat IncuCyte Zoom-inkubatoravbildningssystem från Essen Biosciences [47].

This section is provided by Labome to help guide researchers to identify most suited cell proliferation and cell viability assay kits. Labome surveys formal publications. Table 2 lists the major suppliers for reagents/kits used in the cell-based assays. Some of the applications are enumerated here. Zeng Q et al measured breast cancer cell growth with an MTT cell proliferation kit from Roche [48]. Nam S et al measured cell proliferation in 3D-hydrogel with EdU from Thermo Fisher Scientific [14]. Ombrato L et al assessed the in vitro proliferation of MMTV–PyMT actin–GFP cells in 2D co-culture with MACS-sorted EPCAM+ and Ly6G+ mouse cells using Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kit from Thermo Fisher in a flow cytometer [49]. Silvestre-Roig C et al assayed the cell viability of smooth muscle cells incubated with isolated NETs with propidium iodide, Vybrant MTT cell proliferation assay from Thermo Fisher, and for live imaging, calcein AM from Thermo Fisher [50]. Genet G et al measured the proliferation of HUVEC cells in response to VEGF-A with the xCELLigence RTCA DP analyzer from ACEA Biosciences [3]. Herb M et al assessed the viability of macrophages in culture with the CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay from Thermo Fisher Scientific [51].

supplierkitmetoderexempel på referenser
AbcamDRAQ7cytometry or flow cytometry [46]
Abcamcalcein AMflow cytometry [52]
ACEA BiosciencesxCELLigence RTCA DP analyzerlabel-free [3]
BD PharmingenBrdU Flow Kitflow cytometry [53]
BioLegendcarboxyfluorescein succinimidyl esterflow cytometry [54]
BioLegendTag-it-violetflow cytometry [41]
BioLegendZombie Aquaflow cytometry, immunocytochemistry [55-57]
BioLegendZombie GreenFACS [38]
Dojindo LaboratoriesCell Counting Kit-8 Greenkolorimetri [27]
Essen BioscienceIncuCyte Cytotox Green [45]
MilliporeSigmaBrdUimmunohistochemistry [7]
MilliporeSigmaCell Counting Kit-8 [29]
MilliporeSigmaMTT [48, 58]
PromegaCellTiter 96 AQueouscell imaging [41, 45, 59, 60]
PromegaCellTiter-Gloluminescent assay [46, 61]
PromegaCellTiter-Glo 3Dluminescent assay [62]
PromegaCytoTox 96 [63, 64]
PromegaCytoTox-ONE [33]
PromegaRealTime-Glo MT [65]
RocheWST-1 [66]
Thermo FisherAlamar Bluebildbehandling [24, 25]
Thermo Fishercalcein AMbildbehandling [50]
Thermo FisherCell Proliferation Dye e670flow cytometry [17]
Thermo FisherCellTrace Violet Cell Proliferationflow cytometry [53]
Thermo FisherClick-iT Eduimmunochemistry, flow cytometry [7, 67]
Thermo FisherCyQUANT Direct Cell Proliferation Assaycell imaging [68, 69]
Thermo FisherLIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kitflow cytometry [42]
Thermo FisherSYTOXcell imaging [47, 62]
Thermo FisherVybrant MTTkolorimetri [70]

This article is derived from an earlier version of an article authored by Dr. Laura Cobb "Cell-Based Assays: the Cell Cycle, Cell Proliferation and Cell Death", written in February 2013.


Flow Cytometric Single-Cell Analysis for Quantitative in Vivo Detection of Protein-Protein Interactions via Relative Reporter Protein Expression Measurement

Cell-based two-hybrid assays have been key players in identifying pairwise interactions, yet quantitative measurement of protein-protein interactions in vivo remains challenging. Here, we show that by using relative reporter protein expression (RRPE), defined as the level of reporter expression normalized to that of the interacting protein, quantitative analysis of protein interactions in a bacterial adenylate cyclase two-hybrid (BACTH) system can be achieved. A multicolor flow cytometer was used to measure simultaneously the expression levels of one of the two putative interacting proteins and the β-galactosidase (β-gal) reporter protein upon dual immunofluorescence staining. Single-cell analysis revealed that there exists bistability in the BACTH system and the RRPE is an intrinsic characteristic associated with the binding strength between the two interacting proteins. The RRPE-BACTH method provides an efficient tool to confirm interacting pairs of proteins, investigate determinant residues in protein-protein interaction, and compare interaction strength of different pairs.


Trypan Blue Cell Counting

Trypan Blue is one of several stains recommended for use in dye exclusion procedures for viable cell counting. This method is based on the principle that live (viable) cells do not take up the blue dye, whereas dead (non-viable) cells do. Cell viability can be calculated using the ratio of total live/total cells (live and dead). Staining also facilitates the visualization of overall cell morphology.

NOTE: Trypan Blue has a greater affinity for serum proteins than for cellular protein. If the background is too dark due to the presence of serum in the matrix, cells should be pelleted and resuspended in protein-free medium or salt solution prior to counting.

Bild 6. Cell Counting Using a Hemocytometer and Trypan Blue


Kinetic Analysis of ß-Galactosidase Activity using PowerWave™ HT Microplate Spectrophotometer and Gen5™ Data Analysis Software

The determination of the enzyme kinetic parameters for newly discovered proteins is an important procedure in cellular and molecular biology. Here we describe the use of kinetic reading for the analysis of the bacterial enzyme, ß-galactosidase, using o-nitrophenol-ß-D-galactoside (ONPG) as the substrate.

Introduktion

Most biological processes require an enzyme to act as a catalyst in order for the reaction to take place. With the exception of catalytic RNA, all enzymes are proteins. Most importantly, enzymes are highly effective in catalyzing diverse chemical reactions in a regulated, selective, and specific manner. With a few exceptions, most reactions catalyzed by enzymes can be described satisfactorily by the Michaelis-Menten Equation (Eq. 1),

where v = reaction rate, [S] = substrate concentration, Vmax = maximal velocity, and Km is the Michaelis constant. Each enzyme has physical characteristics with regard to substrate specificity, reaction velocity or required cofactors that affect the Michaelis-Menten constants. The determination of these constants involves the performance of kinetic enzymatic activity measurements. Here we utilize an absorbance-based assay for ß-galactosidase enzyme activity to demonstrate the capabilities of the PowerWave HT Microplate Spectrophotometer in conjunction with Gen5 Data Analysis Software to perform routine analysis of enzyme kinetics in microplates.

The enzymatic product of the LacZ gene, ß-galactosidase, catalyses the hydrolysis of ß-D-galactosides, such as lactose, into their component sugars by hydrolysis of the terminal nonreducing ß-D-galactose residues (Figure 1).

Fortunately the substrate specificity of the enzyme is such that a variety of different substrates, each with a ß-D-galactopyranoside moiety, can be acted upon. Investigators have taken advantage of this by synthesizing compounds which when hydrolyzed by ß-galactosidase result in a colored product. One such compound is o-nitrophenol-ß-D-galactoside (ONPG), which when hydrolyzed forms galactose and o-nitrophenol (Figure 1).

The compound ONP absorbs light at 420 nm whereas the precursor molecule ONPG does not. Therefore, the increase in light absorbance at 420 nm can be used to monitor ß-galactosidase when ONPG is used as a substrate.

Other compounds that possess a conformation similar to ONPG or lactose (i.e. have a ß-D-galactose moiety), can be used in combination with ß-galactosidase. There are several compounds, such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside (X-gal), that form colored insoluble products after hydrolysis. These compounds are quite useful in screening for bacterial plasmid recombinants (1). Bacterial cells containing the LacZ gen (Lac + ) would hydrolyze X-gal and turn blue, while Lac- cells, unable to hydrolyze the compound would remain white. Alternatively, compounds that cannot be hydrolyzed but retain a similar structure would be expected to act as an inhibitor. Phenylethyl ß-D-thiogalactopyranoside (PETG) has a thiol group substituted for the hydroxyl linkage present in compounds that ß-galactosidase normally hydrolyzes (Figure 2). PETG when present in a reaction would be expected to occupy the enzyme and thus inhibit its action on hydrolyzable substrates such as ONPG.

Material och metoder

o-Nitrophenyl ß-D-galactopyranoside (ONPG), catalogue number N-8431, and phenylethyl ß-D-thiogalactopyranoside (PETG), catalogue number P-1692, were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA). The 96-well microplates, catalogue number 3635, were purchased form Corning Life Science, (Cambridge, Massachusetts). ß-galactosidase enzyme cat. # G-6008, sodium phosphate, magnesium chloride and 2-mercaptoethanol were obtained from Sigma-Aldrich Chemical Company (St Louis, Missouri). The ß-galactosidase assay was performed according to Sanbrook et.al (1). 100 ml aliquots of samples or standards diluted in distilled water were placed in each well of a 96-well microplate. The assay was initiated by the addition of 100 ml of 2X assay buffer. Assay buffer (1X) consists of 100 mM sodium phosphate, pH 7.0 1 mM MgCl2 50 mM ß-mercaptoethanol and 0.665 mg/ml ONPG in distilled water. Assay buffer was prepared previously as a 2X stock solution and stored frozen at -20°C. Lyophilized ß-galactosidase enzyme was reconstituted with distilled water to stock concentration of 500 U/ml. Enzyme dilutions were made fresh daily and stored on ice until assayed. A series of enzyme dilutions ranging from 0 to 5 U/ml of ß-galactosidase (ß-gal) were then made using distilled water as the diluent. All absorbance determinations were made at 420 nm using a PowerWave&trade HT Microplate Spectrophotometer (BioTek Instruments, Winooski, VT) with the reader controlled by Gen5 Data Analysis Software (BioTek Instruments, Winooski, VT). After the assay was initiated by the addition of the 2X assay buffer, kinetic readings were initiated immediately with absorbance determinations made every 30 seconds for a total of 60 minutes at ambient temperature.

In order to examine the effect of the inhibitor PETG on ß-gal activity a series of dilutions were made and added to the reaction mixture. Stock solutions (10 mg/ml) of PETG were made in acetonitrile and stored at -20°C until needed. Further dilutions ranging from 0 to 1000 µg/ml were then made using 1X assay buffer as the diluent. These dilutions were added to equivalent ß-gal reactions. To each well, 100 µl of 0.25 U/ml ß-gal enzyme was added along with 100 µl of the appropriate inhibitor dilution in 1X reaction buffer. As before, the assay was initiated by the addition of 100 µl of 2X reaction buffer containing ONPG as the substrate. Subsequent data reduction was performed using Gen5 software.

In order to determine Michaelis-Menten equation values, a series of dilutions of the ONPG substrate were utilized. A 20 mM stock solution of ONPG substrate in 2X reaction buffer was prepared and dilutions from 0 to 20 mM were made using 2X reaction buffer without ONPG as the diluent. Aliquots of 100 µl for each dilution were pipetted into microplate wells in replicates of 8. Reactions were initiated by the addition of 100 µl of 0.25 U/ml ß-galactosidase in water to each well and kinetic absorbance reading performed as previously described. In experiments where PETG was used in conjunction with variable ONPG substrate concentrations, reactions were performed in duplicate.

Resultat

The absorbance of enzyme concentrations ranging from 0 to 5 U/ml were read kinetically. When absorbance values are plotted as a function of time, enzyme concentrations up to 0.1 U/ml are linear for at least 60 minutes (Figure 3). Enzyme concentrations above 0.5 U/ml result in a plateau of absorbance prior to 60 minutes, with the 5 U/ml samples reaching maximal values by 2 minutes. When Vmax values are calculated from these data and plotted against enzyme concentration using Gen5 a linear relationship is observed (Figure 4). Using a polynomial regression analysis of these data an equation describing this relationship can be used with a high degree of confidence, as the coefficient of determination (R 2 ) is 0.9998. When data from enzyme concentrations up to 1 U/ml are considered, the Vmax response is linear. Linear regression analysis of this subset of the data results in a coefficient of determination (R 2 ) of 0.998 (data not shown).

The effect of substrate concentration on velocity was analyzed. As demonstrated in Figure 5, the velocity of the reaction increases dramatically as the ONPG substrate concentration is increased to 2 mM in the presence of 0.25 U/ml of purified ß-galactosidase enzyme. ONPG levels above 2 mM do not appreciably increase the reaction rate. An estimation of Vmax and Km can be made from these data. Using a 4-Parameter logistic fit of the data to describe the data, Vmax can be estimated from parameter &ldquod&rdquo (theoretical response at infinite concentration) of the equation (2). Using this method, the Vmax was determined to be 33.4 mOD/min (Figure 5).

The Michaelis constant or Km, which represents the substrate concentration, which results in half-maximal velocity, can also be calculated using Gen5 and was determined to be 0.24 mM in this experiment.

Although the value for Km is equal to the substrate concentration ([S]) at half-maximal velocity (Vmax/2), direct determination of Vmax is frequently difficult to obtain experimentally. Michaelis-Menten values for Km och Vmax have been estimated from several transformations of the original equation. These transformations include the Eadie-Hofstee and the Lineweaver-Burk plots. The Eadie-Hofstee transformation plots velocity against the velocity divided by the substrate concentration (Eq. 2)

The Lineweaver-Burk or double reciprocal transformation plots the reciprocal of velocity (1/v) against the reciprocal of substrate concentration (1/[S]) (Eq. 3). These types of plots, which generate linear regressions, allow the investigator to more easily determine Km och Vmax. When using the Eadie-Hofstee transformation (Eq. 2) the slope is equal to &ndashKm, while Vmax is determined from the y-intercept.

Using this transformation we determined an apparent Km of 0.1556 mM for the enzyme and a Vmax of 34.89 mOD/min (Figure 6). Using a Lineweaver-Burk plot, Vmax, which can be calculated from the reciprocal of the y-intercept, was determined to be 39.1 mOD/min (Figure 7). The apparent Km, which can be calculated from the slope of the line (slope = Km/Vmax), was determined to be 0.3449 mM (Figure 7).

The effect of PETG on the ß-galactosidase enzyme activity was investigated. ß-galactosidase reactions containing equal amounts of both enzyme and ONPG substrate were read kinetically in the presence of increasing amounts of the non-hydrolyzable compound PETG. Increasing amounts of PETG result in a sigmoidal decrease in the Vmax values for ß-galactosidase (Figure 8). Inhibitor concentrations above 1000 µg/ml result in virtually no enzyme activity, while concentrations below 0.15 µg/ml demonstrate very little inhibition.

The influence of inhibitor on the substrate concentration ([S]) reaction velocity (v) relationship was investigated. As demonstrated in Figure 8, when a constant amount of enzyme is incubated with increasing amounts of substrate in the presence of PETG, the ability to reach the maximal reaction rate (Vmax) is diminished. When the substrate is in large excess relative to the inhibitor, Vmax is achieved (Figure 9, red line). However, when a relatively large amount of inhibitor relative to substrate is present (Figure 9, green line) then Vmax cannot be achieved. When Lineweaver-Burk plots are made using these data, regression lines with different slopes are observed, suggesting that the inhibitor influences the Km of the reaction (Figure 10). The linear regressions all relatively have the same y-intercept point indicating that all of the reactions have the same Vmax. When the Vmax values are calculated using Gen5 from the y-intercepts of the plots values of 30.94, 30.65, and 26.07 mOD/min are obtained for samples containing 0, 0.167, and 1.67 mM PETG respectively.

Diskussion

Initial experiments demonstrate the importance of reaction concentrations. Maintaining an appropriate relationship between the catalytic enzyme concentration, substrates, and incubation time is paramount in obtaining appropriate linearity in the assay. For example, the plateau of absorbance seen with the higher enzyme concentrations indicates that either shorter incubation times (e.g. 2 to 5 minutes) would provide superior linearity for these enzyme concentrations. Lower enzyme concentrations can be used to maintain linearity for 30 or 60 minute incubations. Increasing the ONPG substrate concentration is limited by the solubility of the compound in the aqueous reaction buffer and by the microplate reader absorbance limits.

The reaction kinetics for this enzyme would be expected to be linear with regard to Vmax and enzyme concentration. Because the monomeric protein interacts with one substrate at a time, allosteric binding effects would not be observed. The tailing off of the Vmax seen in Figure 4 at the highest enzyme concentration tested is most likely due to rapid depletion of ONPG substrate within 60 seconds (two time points). This is corroborated by the data in Figure 3, which demonstrates the rapidity of reaching maximal absorbance for high concentrations of enzyme.

When reaction velocity is plotted against substrate concentration maximal velocity Vmax and Km kan bestämmas. With a 4-parameter logistic fit an estimate of maximal velocity is made using parameter &ldquod&rdquo. The Michaelis constant can then be calculated by entering in the value &ldquoVmax/2&rdquo using the interpolation function of Gen5. The resultant concentration returned is the Km. Because of the difficulty of estimating the Vmax prior to the advent of computers, several methods were developed to determine these values using linear regression. Two such examples are the Eadie-Hofstee transformation and Lineweaver-Burk plots. Similar results were obtained for Vmax regardless of the method. Interestingly, the average of these two means of determining Km (0.25 mM) results in a value very close to that determined from the original velocity vs. substrate concentration plot (Figure 5) which was 0.24 mM. Although the calculated Km for ONPG is higher than reported values for ß-galactosidase using lactose as the substrate (3), it is not remarkably greater.

The inhibitor PETG is a non-hydrolyzable substrate for ß-gal. The substitution of a thiol linkage for a hydroxyl group eliminates hydrolysis (Figure 3). Experiments with PETG suggest that the inhibitor has an equal affinity for the enzyme as the substrate ONPG. The molar concentration at which PETG begins to affect enzyme activity is very close to the concentration of the ONPG substrate indicating similar affinities. If the enzyme had a greater affinity for ONPG than PETG then inhibition would have required proportionally more of the inhibitor to elicit the same response.

These data presented also indicate that PETG is a competitive rather than a non-competitive inhibitor of ß-galactosidase. Measurements of the reaction rates at different concentrations of substrate and inhibitor serve to distinguish between competitive and non-competitive inhibition. Competitive inhibitors compete for enzyme binding sites and as such, a large excess of substrate to inhibitor will result in reaction rates similar to samples that do not contain inhibitor. This would result in Vmax values that are equivalent to that of enzyme without inhibitors present (Figure 10). The discrepancy between the calculated Vmax for the 1.67 mM PETG samples and controls (0 mM PETG) is the result of ONPG not being in sufficient excess. Noncompetitive inhibitors would show different Vmax values regardless of the substrate concentration (3). PETG also presents chemical structure very similar to ONPG, suggesting that it will bind to the active binding site of the ß-galactosidase enzyme. In the past such kinetic determinations have been performed using a conventional spectrophotometer, which usually entails the use of matched cuvettes to perform the analysis, resulting in a very low throughput. The ability to use the PowerWave&trade HT Microplate Reader to perform this analysis allows this routine procedure to be performed on 96 samples in a matter of seconds leading to a tremendous increase in productivity and throughput. These data presented in this report also demonstrate the utility of Gen5 Data Analysis Software to perform routine enzyme kinetic studies. Automatic determination of values such as Vmax and Km allows the end user flexibility in regards to data reduction of kinetic assays.

Referenser

(1) Sanbrook J. E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.

(2) BioTek Instruments, Application Note &ldquoBioTek&rsquos 4-Parameter Logistic Fit&rdquo, Winooski, Vermont.


Introduktion

Cell-to-cell heterogeneity is a feature of processes of great interest in basic and disease research (for example, cancer metastasis 1, 2 and drug responses of tumor cells 3, 4, 5 ). Understanding of these processes can benefit greatly from single-cell measurements, especially those that can relate differences in function or phenotype and the extracellular microenvironment to variations in intracellular state of individual cells. 6, 7 Traditional cellular assays, however, due to sensitivity limitations, measure average properties of large numbers (usually 10 3 � 6 ) of cells. Such measurements mask the differences between individual cells. 3, 8, 9

Several current techniques allow assaying cells individually for differing types of information. Harnessing nucleic acid amplification and sequencing technologies, a number of assays measure genetic information and gene expression from single cells. 10, 11, 12, 13, 14 Microfluidic realizations of these assays achieve high sensitivity and throughput. Most such techniques, however, require cells in suspension. Placing adherent cells in suspension destroys information about tissue context, and makes it difficult to relate measured variations to this context or to phenotypic differences observable only when cells are adherent to a substrate.

Since even genetically identical cells may respond differently to the same cues, 3, 4, 5 as many additional layers of regulation determine cellular behavior, single-cell measurement at the protein level is desirable. Assaying for protein levels, localization or activity from single cells faces additional challenges over gene-based assays, not only due to the lack of a generic amplification scheme but also because proteins are dynamic on a shorter time-scale (and thus more quickly responsive to unwanted perturbations introduced by the assay method). The ability to make measurements of signaling proteins, for example kinases, at the single-cell level is especially relevant to the major goal of understanding how a cell processes information from external cues to generate a response. This can help in understanding how to alter cell outcomes in a controlled manner, which has great implications for therapeutics. 3, 4, 5 Thus a means to obtain a clear picture of signaling events in a cell, and ideally clarify the connection between signaling and phenotype for a particular cell while knowing its external context, is desirable.

For examining cell signaling events, protein activity is more relevant than protein level, reporting more directly on actions occurring in the cell. However, levels of proteins and protein post-translational modification (PTM) states, which are less challenging to measure, are often used as proxies for the actual activity. Flow and phospho-flow cytometry, as well as mass cytometry, 15 enable high-throughput multiplexed measurements of these from single cells, but have several drawbacks. A first problem is the assumption that the phosphorylation state of a kinase is a good proxy for its activity. Because of the complex and incompletely understood nature of signaling regulation via phosphorylation (and other protein PTMs), this is not necessarily the case, including for heavily-studied kinases such as Akt. 16, 17, 18 A corollary issue is that even for cases in which an identified PTM state definitively governs activity level, this can often involve multiple PTMs which are typically not quantified concomitantly. 19 A second challenge is that these assays generally rely on the existence of high-quality antibodies specific for the protein or protein PTM of interest. Third, such assays do not easily permit association of the molecular signaling measurements with a phenotypic characterization of any given cell (other than via surrogate molecular markers), so a goal of ascertaining relationships between signaling state and phenotypic behavior on a cell-to-cell level is elusive. Finally, these assays, as well as microfluidic approaches to single-cell protein-level measurement, 20 predominantly require a suspension step before measurement can be undertaken, which is likely to affect signaling.

Direct measurements from single adherent cells, at the genetic or protein level, without perturbing the cells and their extracellular milieu are therefore highly desirable, but limited means currently exist to accomplish this. 21 For the particularly challenging case of measuring protein activities, only a few methods exist, each with its difficulties. Injected sensors present challenges with specificity and stability, and injection disrupts the cell. 22 Live-cell imaging using genetically encoded reporters can provide dynamic information on protein levels and localization or on activity directly, 23 but such reporters are difficult to multiplex, and genetic manipulation presents the risk of affecting the system under study. The approach is also highly resource-intensive, and presents challenges in obtaining quantitative measurements. 24

We have previously used a microfluidic concentrator device to fluorescently monitor specific kinase activities from unfractionated cell lysates using peptide sensors incorporating the non-natural amino acid Sox, a chelation-enhanced fluorophore. 25, 26 This achieved the sensitivity to measure kinase activity from an amount of bulk-level cell lysate estimated to be equivalent to a few cells' worth. To perform this assay directly on a single cell selected from an adherent cell population, however, requires development of the novel capability to selectively lyse an individual adherent cell, and capture its contents while limiting dilution to retain assay sensitivity. Such a capability would open up the sensitivity, throughput and automation advantages conferred by microfluidics to a host of biochemical assays and enable their use at the single-cell level while retaining the ability to integrate these measurements with existing data from standard assay platforms.

In the current work, we have developed an integrated microfluidic probe device that assays the contents of single adherent cells from standard tissue culture. It achieves selective single cell lysis by hydrodynamic confinement of a lysis buffer at its tip and captures the contents of single cells and mixes them with assay reagents in nanoliter-scale integrated chambers to perform high sensitivity single-cell assays. We demonstrate the selective lysis and capture of the contents of single adherent cells without disrupting neighboring cells even in near-confluent cultures. We then use the device to measure kinase and housekeeping protein activities, simultaneously or separately, directly from single hepatocellular carcinoma (HepG2) cells in adherent tissue culture. We demonstrate that this approach can characterize biological heterogeneity in Akt kinase activity levels among cells under insulin stimulation.